輻照培養(yǎng)基適用性改善及Bacillus firmus GL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶對(duì)其適用性的影響

徐玲，寧喜斌,2,3,4*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)4(國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海)，上海，201306)

隨著新版藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practices，GMP)的深入落實(shí)，更加標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)罐裝培養(yǎng)平皿被應(yīng)用于潔凈環(huán)境的微生物監(jiān)測(cè)。無(wú)菌預(yù)罐裝培養(yǎng)平皿是經(jīng)鈷60輻照終端滅菌的培養(yǎng)基[1]。一定劑量的輻照可以確保無(wú)菌但會(huì)引起其他物質(zhì)的物理和化學(xué)變化，抑制某些類(lèi)群微生物的生長(zhǎng)[2-5]。為確保監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須要對(duì)輻照培養(yǎng)基進(jìn)行適用性檢查并提高輻照培養(yǎng)基的適用性。前人研究指出[6-8]，金屬離子或某些還原性較強(qiáng)的化合物對(duì)過(guò)氧化物有不同的影響。1991年，MARTHI等[9]首次報(bào)道了氨基酸的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)氨基酸的抗氧化活性很高。另外，微生物來(lái)源的過(guò)氧化氫酶由于其高活性、快速繁殖、易于處理并且可作為解毒系統(tǒng)，抵抗不同氧化反應(yīng)形成的活性氧[10-12]。因此尋找改善輻照培養(yǎng)基的添加劑和研究添加劑的作用，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球ATCC 6538、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、銅綠假單胞菌ATCC 9023、白色念珠菌ATCC 10231、黑曲霉ATCC 16404、人參土芽孢桿菌對(duì)胰酪大豆胨瓊脂(tryptic soy agar，TSA)輻照培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[13]。同時(shí)，通過(guò)延長(zhǎng)輻照培養(yǎng)基貯存時(shí)間以及向輻照培養(yǎng)基中添加某些無(wú)菌還原性化合物(過(guò)氧化氫酶、五倍子酸、抗壞血酸、硫胺素、焦性沒(méi)食子酸)、氨基酸(主要是L-半胱氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸)、金屬離子(Mg2+、Cu2+、K+、Mn2+、Zn2+、Fe3+)、產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株(C3、H1、GL3、H5、1-5、1-10、2-4、2-9)的無(wú)菌發(fā)酵液等，觀察各因素對(duì)輻照培養(yǎng)基中微生物恢復(fù)生長(zhǎng)有何種直接影響，來(lái)反映各因素對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的改善效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與試劑

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 6633、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9023、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231、黑曲霉(Aspergissusniger)ATCC 16404、人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)，由上海諾狄生物科技有限公司及本實(shí)驗(yàn)室提供；菌株C3、H1、GL3、H5、1-5、1-10、2-4、2-9，分別篩選自上海東海海水及藥廠潔凈環(huán)境，其中GL3是具有高過(guò)氧化氫酶活性的菌株，經(jīng)生理生化鑒定后命名為BacillusfirmusGL3(B.firmusGL3)。以上菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存在-80℃冰箱。

實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，分為輻照終端滅菌與對(duì)照培養(yǎng)基2種。

種子培養(yǎng)基，胰酪大豆胨液體(TSB)培養(yǎng)基和2216E液體培養(yǎng)基(用于海生細(xì)菌培養(yǎng))，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-VIS 2 300，上海天美科學(xué)儀器有限公司； 臺(tái)式pH730精密測(cè)試儀，德國(guó)WTW；ClassⅡBSC生物安全柜，ESCO公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 輻照培養(yǎng)基適用性檢查

按照《中國(guó)藥典》2015年版四部“1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查。微生物計(jì)數(shù)法”的規(guī)定[14-16]培養(yǎng)基的適用性以菌落回收率和菌落形態(tài)作為判定標(biāo)準(zhǔn)。潔凈環(huán)境監(jiān)測(cè)用的TSA培養(yǎng)基經(jīng)輻照終端滅菌后產(chǎn)生自由基的氧化反應(yīng)，因此要對(duì)輻照TSA培養(yǎng)基進(jìn)行適用性檢查。

菌液制備：將5種標(biāo)準(zhǔn)菌株和人參土芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物，用0.9%的無(wú)菌生理鹽水稀釋成不大于100 CFU/mL的菌懸液。取各供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于對(duì)照TSA培養(yǎng)基、輻照TSA培養(yǎng)基上，置于30～35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每個(gè)TSA培養(yǎng)基上的供試菌都要有3次平行實(shí)驗(yàn)，最后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并觀察菌落形態(tài)及菌落分布均勻情況如公式(1)所示。

(1)

1.2.2 影響輻照培養(yǎng)基適用性的因素

主要考察輻照培養(yǎng)基貯存時(shí)間以及輻照培養(yǎng)基中添加某些輔助添加劑對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響，添加劑都經(jīng)過(guò)0.25 μm的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌。實(shí)驗(yàn)以敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC 6538和人參土芽孢桿菌為供試菌，菌液制備同1.2.1所述。

1.2.2.1 培養(yǎng)基貯存時(shí)間對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于經(jīng)鈷60輻照滅菌后貯存0、5、10、15、20、25 d的TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2.2 還原性化合物對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加有10 μL 0.1 mol/L的無(wú)菌還原性化合物硫脲、五倍子酸、抗壞血酸、硫胺素、焦性沒(méi)食子酸的輻照TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2.3 氨基酸對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加10 μL 0.1 mol/L的氨基酸L-半胱氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的輻照TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2.4 金屬離子對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加10 μL 0.1 mol/L的金屬離子Mg2+、Cu2+、K+、Mn2+、Zn2+、Fe3+的輻照TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2.5 粗酶發(fā)酵液對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

將菌株C3、H1、GL3、H5、1-5、1-10、2-4、2-9的發(fā)酵液在10 000 r/min的條件下離心10 min，并將上清液通過(guò)0.25 μm的細(xì)菌過(guò)濾器以除去細(xì)菌。取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加10 μL 0.1 mol/L的無(wú)菌粗酶發(fā)酵液的輻照TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3 菌株GL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶條件的優(yōu)化及應(yīng)用

菌株GL3是前期通過(guò)生理生化鑒定的1株高過(guò)氧化氫酶活性菌株。在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)pLackett- burman(PB)實(shí)驗(yàn)篩選出顯著影響因素并利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)(box-benhnken design, BBD)優(yōu)化顯著因素的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以期獲得更高過(guò)氧化氫酶活性為改善培養(yǎng)基的適用性奠定基礎(chǔ)。

1.2.3.1 過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定無(wú)菌體發(fā)酵液的酶活性[17-18]。以過(guò)氧化氫在240 nm處的分解速率計(jì)算酶活性。反應(yīng)體系為pH=7，50 mmol/L的磷酸緩沖液，H2O2濃度30 mmol/L。取40 μL粗酶液加入2 mL磷酸緩沖液中，在比色杯中混勻，在迅速加入以磷酸緩沖液配制的30 mmol/L的H2O21 mL起始反應(yīng)，反應(yīng)總體積為3.04 mL。酶活性單位(1U)定義為25 ℃每分鐘降解1 μmol H2O2(1 μmol/min)。酶活性計(jì)算如公式(2)：

(2)

式中：ΔA，240 nm下的吸光度變化值；Δt，反應(yīng)時(shí)間，min；D，粗酶的稀釋倍數(shù)；Vm，反應(yīng)總體積，mL；M，1 μmol/mL過(guò)氧化氫在 240 nm處的吸光度，其值為0.043 6；V0，稀釋的粗酶體積，mL；酶活性，U/mL。

1.2.3.2 顯著因素篩選實(shí)驗(yàn)

由于NaCl(g/L)、pH、時(shí)間(h)、溫度(℃)、H2O2(%)、接種量(%)、Mg2+(g/L)和裝液量(mL)都會(huì)影響菌株GL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的活性。因此通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)對(duì)上述8因素進(jìn)行顯著因素的篩選。

1.2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

對(duì)篩選的顯著因素采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行菌株GL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶活性的條件優(yōu)化，最后在優(yōu)化條件下得到GL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的最優(yōu)酶活性。

1.2.3.4B.firmusGL3優(yōu)化后發(fā)酵液的應(yīng)用

向輻照TSA培養(yǎng)基分別添加10 μL 0.1 mol/L的過(guò)氧化氫酶、未優(yōu)化的GL3無(wú)菌粗酶發(fā)酵液以及優(yōu)化后的GL3無(wú)菌粗酶發(fā)酵液，最后每個(gè)TSA培養(yǎng)基分別接種0.1 mL供試菌的菌懸液，并置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照培養(yǎng)基適用性檢查

《中國(guó)藥典》規(guī)定被檢培養(yǎng)基菌落數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)比值應(yīng)在0.5～2，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致[19]。通過(guò)各種供試菌在對(duì)照培養(yǎng)基與輻照培養(yǎng)基上菌落回收數(shù)率的比較可知(表1)，輻照培養(yǎng)基中供試菌金黃色葡萄球菌ATCC 6 538和人參土芽孢桿菌的菌落回收率低于50%，且菌落分布較均勻；而其余供試菌的菌落回收率正常，菌落分布均勻。表明輻照后培養(yǎng)基發(fā)生自由基的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生某種物質(zhì)抑制金黃色葡萄球菌和人參土芽孢桿菌的正常生長(zhǎng)。

表1 TSA輻照培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果Table 1 The suitability test results of TSA irradiation medium

2.2 不同因素對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

2.2.1 貯存時(shí)間對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

比較了輻照終端滅菌的培養(yǎng)基貯存時(shí)間對(duì)其適用性的影響，結(jié)果如圖1所示。圖1結(jié)果顯示輻照培養(yǎng)基貯存期在0～15 d，2種供試菌的生長(zhǎng)仍然受到抑制；當(dāng)貯存時(shí)間超過(guò)15 d后，2種供試菌的生長(zhǎng)恢復(fù)正常。此研究結(jié)果表明輻照對(duì)敏感菌的抑制作用能夠隨培養(yǎng)基貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而消失。對(duì)于輻照的TSA培養(yǎng)基貯存15 d后可以正常使用。

圖1 貯存時(shí)間對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響Fig.1 The effect of storage time on the suitability of irradiation medium

2.2.2 有機(jī)化合物對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

比較了不同化合物對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響，結(jié)果如圖2所示。考慮到輻照產(chǎn)生自由基的氧化反應(yīng)，在輻照培養(yǎng)基中添加各種具有還原性的化合物后，金黃色葡萄球菌與人參土芽孢桿菌的菌落生長(zhǎng)有所恢復(fù)，其中焦性沒(méi)食子酸與五倍子酸對(duì)輻照培養(yǎng)基中菌株恢復(fù)生長(zhǎng)的效果比硫胺素、硫脲、抗壞血酸的恢復(fù)效果好，但是2種菌菌落總數(shù)還是低于對(duì)照培養(yǎng)基中的菌落總數(shù)。

圖2 還原性化合物對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響Fig.2 The effect of reducing compounds on thesuitability of irradiation medium

2.2.3 氨基酸對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

比較了不同氨基酸對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響，結(jié)果如圖3所示。輻照產(chǎn)生自由基的氧化反應(yīng)，輻照培養(yǎng)基中不同外源氨基酸的添加對(duì)自由基的清楚能力不同。輻照培養(yǎng)基中添加蛋氨酸、丙氨酸、絲氨酸后，對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 6538和人參土芽孢桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用；而L-半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的添加能夠促進(jìn)2種供試菌在輻照培養(yǎng)基的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)表明L-半胱氨酸、酪氨酸對(duì)輻照產(chǎn)生的自由基清除能力最強(qiáng)，苯丙氨酸次之；蛋氨酸、丙氨酸、絲氨酸無(wú)自由基的清楚能力。此研究結(jié)果與李新、許猛的研究結(jié)果一致[20-21]。

圖3 氨基酸對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響Fig.3 The effect of amino acids on the applicability of irradiated medium

2.2.4 金屬離子對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

比較了不同金屬離子對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響，結(jié)果如圖4-a所示。多種金屬離子的添加對(duì)輻照培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)具有直接的影響，Mg2+、Mn2+、K+的添加對(duì)輻照培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，而培養(yǎng)基中Cu2+、Fe3+的添加對(duì)微生物生長(zhǎng)具有抑制作用，Zn2+對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響不大。此研究結(jié)果與RICCIARDI等和JUNILLON等的研究結(jié)果一致[22-23]。同時(shí)比較了不同金屬離子對(duì)金黃色葡萄球菌和人參土芽孢桿菌的過(guò)氧化氫酶活性的影響(圖4-b)，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Mg2+、Mn2+、K+的添加可以促進(jìn)2種菌過(guò)氧化氫酶的產(chǎn)生，而Cu2+、Fe3+的添加對(duì)菌株的過(guò)氧化氫酶活性有抑制作用。以上研究結(jié)果表明，輻照產(chǎn)生自由基的氧化反應(yīng)主要生成過(guò)氧化氫，2種供試菌對(duì)輻照產(chǎn)生的過(guò)氧化氫敏感，特別是人參土芽孢桿菌；另外，菌株過(guò)氧化氫酶活性的提高可以抵消過(guò)氧化氫對(duì)敏感菌株的脅迫作用。

a-菌落總數(shù)；b-相對(duì)酶活性圖4 金屬離子對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性及供試菌酶活性的影響Fig.4 The applicability of metal ions to irradiation medium and the activity of enzymes for test bacteria

2.2.5 篩選菌株的粗酶發(fā)酵液對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響

輻照培養(yǎng)產(chǎn)生自由基氧化反應(yīng)形成過(guò)氧化氫，它可以被過(guò)氧化氫酶利用。FREY等和STRUHARNANSKA等[24-25]證明過(guò)氧化氫酶可以用作敏感菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基的良好添加劑。通過(guò)從上海市東海海水與藥廠潔凈環(huán)境中篩選出8株高過(guò)氧化氫酶活性菌株，從中提取各菌株的無(wú)菌體粗過(guò)氧化氫酶發(fā)酵液。比較了8株篩選菌株的粗過(guò)氧化氫酶發(fā)酵液對(duì)輻照培養(yǎng)基適用性的影響。結(jié)果如圖5所示，具有高過(guò)氧化氫酶活性的菌株粗酶發(fā)酵液對(duì)受過(guò)氧化氫脅迫的敏感菌生長(zhǎng)有復(fù)蘇作用。菌株GL3的粗酶發(fā)酵液對(duì)敏感菌的促生長(zhǎng)作用效果相較于其他產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的菌株效果最好。因此決定對(duì)菌株GL3進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖5 粗酶發(fā)酵液對(duì)培養(yǎng)基適用性的影響Fig.5 The effect of crude enzyme fermentation broth on the suitability of medium

2.3 菌株GL3產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及應(yīng)用結(jié)果

2.3.1 顯著因素的篩選結(jié)果

根據(jù)《伯杰細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第九版)并參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的部分方法對(duì)菌株GL3進(jìn)行生理生化鑒定并將菌株GL3的16SrDNA基因序列進(jìn)行在線(xiàn)Blast比對(duì)分析。根據(jù)GL3的形態(tài)特征、生理生化鑒定結(jié)果以及GL3的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將GL3鑒定為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)并命名為BacillusfirmusGL3。利用PB設(shè)計(jì)對(duì)影響B(tài).firmusGL3的產(chǎn)過(guò)氧化氫酶活性的的8因素進(jìn)行篩選。篩選出最顯著因素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。利用Minitab17對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明回歸方程顯著(P=0.001)，R2=0.999 7表明該模型可信。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值表(N=12)Table 2 The design and response table of Plackett-Burman experiment

PB實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鼋Y(jié)果如表3所示，顯著性排序?yàn)镸g2+含量>培養(yǎng)時(shí)間>NaCl>裝液量>H2O2含量>初始pH>接種量>培養(yǎng)溫度，P<0.05的因素對(duì)響應(yīng)面有顯著影響，因此進(jìn)一步選擇Mg2+(g/L)、培養(yǎng)時(shí)間(h)、NaCl(g/L)3個(gè)顯著影響因素進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.3.2 顯著因素響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面的中心復(fù)合設(shè)計(jì)得到NaCl、培養(yǎng)時(shí)間、Mg2+的最佳組合。酶活性的優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4所示，當(dāng)NaCl為11.24 g/L，培養(yǎng)時(shí)間18.09 h，Mg2+為0.54 g/L時(shí)，預(yù)測(cè)B.firmusGL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶活性高達(dá)21 013.8 U/mL。為了驗(yàn)證響應(yīng)面所得的最佳產(chǎn)酶活性條件的可實(shí)施性，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件,NaCl為11.24 g/L，培養(yǎng)時(shí)間18 h，Mg2+為0.54 g/L為最佳產(chǎn)酶活性條件，分別進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，所得B.firmusGL3的過(guò)氧化氫酶活性為(20 668±103) U/mL，結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本一致，證明優(yōu)化模型有效。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of the Plackett-Burman experiment

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

表4 過(guò)氧化氫酶活性的優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Optimization prediction results of catalase activity

2.3.3 優(yōu)化后B.firmusGL3粗酶發(fā)酵液應(yīng)用結(jié)果

菌株B.firmusGL3產(chǎn)高過(guò)氧化氫酶活性的條件通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后，結(jié)果相比未優(yōu)化的過(guò)氧化氫酶活性提高了78.84%。優(yōu)化后B.firmusGL3粗酶發(fā)酵液應(yīng)用結(jié)果如圖6所示，以未接種菌株B.firmusGL3的液體發(fā)酵液作為空白對(duì)照，將優(yōu)化過(guò)的菌株B.firmusGL3產(chǎn)生的過(guò)氧化氫酶粗酶發(fā)酵液無(wú)菌添加到輻照的TSA培養(yǎng)基后，優(yōu)化后的粗酶發(fā)酵液對(duì)2種供試敏感菌金黃色葡萄球菌ATCC 6 538和人參土芽孢桿菌的具有促生長(zhǎng)作用。由圖6可知優(yōu)化后的粗酶發(fā)酵液對(duì)2種供試菌的促生長(zhǎng)作用效果最佳，且趨向于純過(guò)氧化氫酶的作用效果。

圖6 優(yōu)化的B. firmus GL3粗酶發(fā)酵液的應(yīng)用結(jié)果Fig.6 Optimized application results of B. firmus GL3 crude enzyme fermentation broth

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)輻照的TSA培養(yǎng)基進(jìn)行適用性檢查發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC 6538與人參土芽孢桿菌在輻照TSA培養(yǎng)基上的菌落回收率低于50%，結(jié)果表明商業(yè)TSA培養(yǎng)基經(jīng)輻照終端滅菌后產(chǎn)生有毒物質(zhì)抑制了2種供試菌的生長(zhǎng)。在輻照培養(yǎng)基貯存15 d以后，輻照TSA的培養(yǎng)基中2種供試菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)還原性化合物焦性沒(méi)食子酸與五倍子酸，氨基酸L-半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，金屬離子Mg2+、Mn2+、K+以及高過(guò)氧化氫酶菌株的粗酶發(fā)酵液對(duì)輻照培養(yǎng)基中敏感菌株的恢復(fù)生長(zhǎng)有一定的作用。

盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)于微生物產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的研究一直沒(méi)有中斷，但相對(duì)于它們的潛力，大多數(shù)商業(yè)過(guò)氧化氫酶都無(wú)法承受惡劣的工藝條件并且在實(shí)際的工業(yè)領(lǐng)域規(guī)模化生產(chǎn)中報(bào)道的微生物過(guò)氧化氫酶還未獲得廣泛應(yīng)用[26-27]。因此開(kāi)發(fā)高活性、穩(wěn)定的、新型微生物過(guò)氧化氫酶迫在眉睫，本研究通過(guò)前期篩選分離得到的高過(guò)氧化氫酶菌株GL3，經(jīng)生理生化鑒定將其命名為B.firmusGL3。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)將菌株B.firmusGL3產(chǎn)過(guò)氧化氫酶活性提高了78.84%，優(yōu)化后的粗酶發(fā)酵液對(duì)2種供試菌的促生長(zhǎng)作用效果最佳，與純過(guò)氧化氫酶的作用效果基本一致。因此，優(yōu)化的B.firmusGL3的過(guò)氧化氫酶粗酶發(fā)酵液不僅對(duì)改善輻照培養(yǎng)基適用性具有重要作用，也為工業(yè)生產(chǎn)過(guò)氧化氫酶及其應(yīng)用提供參考依據(jù)。