不同高壓均質條件對羅望子濁汁穩(wěn)定性及抗氧化活性的影響

劉孝平，劉路，魯炫池，段昕梅，張玲，陳安均

(四川農(nóng)業(yè)大學，四川 雅安，625014)

羅望子(TamarindusindicaL.)屬于蘇木科(Caesalpiniaceae)酸角屬(Tamarindus)，又稱酸角、酸豆、羅晃子等。羅望子果肉含有豐富的糖類、有機酸、氨基酸和礦物質元素。除此之外，羅望子果肉中還含有較多的多糖類、酚類和黃酮類化合物[1-2]及豐富的生物活性物質[3]，可以被加工為糕點、蜜餞、果脯、果肉粉、濃縮汁和咖喱粉等產(chǎn)品[4]。

如今，隨著生活水平的提高，人們的消費觀念發(fā)生變化，人們開始熱衷選擇營養(yǎng)豐富的渾濁型果汁飲料。渾濁型羅望子飲料最主要的問題是在貯藏和運輸過程中會出現(xiàn)固體顆粒的沉淀，這會對消費者的感官造成負面影響[5]。而非熱加工是目前果汁加工的趨勢，例如通過高壓均質、超高壓[6]、超聲[7]和高壓脈沖電場[8]等處理來保護果汁的營養(yǎng)品質或延長貨架期，其中高壓均質是應用最廣泛的加工方式之一。

根據(jù)Stokes公式，顆粒沉降速度與顆粒粒徑成正比，顆粒尺寸越小，沉降速度越慢，因而在果汁加工中常用均質處理降低果汁顆粒的粒徑，以提高產(chǎn)品的物理穩(wěn)定性。高壓均質能夠破壞食品基質，破壞果肉細胞的完整性，將細胞破碎成碎片，從而導致果汁的平均粒徑降低，顆粒分布變窄，果汁穩(wěn)定性增強。但是高壓均質處理時，樣品經(jīng)過高壓均質閥時受壓力、剪切力、高速碰撞、空穴效應等作用可能會對果汁中生物活性物質產(chǎn)生一些難以控制的影響。

高壓均質技術可以用于改善各種果汁的物理穩(wěn)定性，但是目前沒有關于利用高壓均質處理羅望子濁汁的相關研究。本研究的目的是：(1)研究高壓均質處理條件對羅望子濁汁物理穩(wěn)定性的影響(離心沉淀率、清液濁度、粒徑分布)；(2)盡量減小高壓均質處理對羅望子濁汁生物活性的影響(總酚、總黃酮、多糖含量和抗氧化能力)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟的甜型羅望子果實產(chǎn)自云南省西雙版納，購于昆明市建航商貿(mào)有限公司。運至實驗室后立即剔除受到蟲害和霉變的果實，剝?nèi)」饷芊夂笤?20 ℃冰箱存放。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、水楊酸、三氯乙酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、氯化鐵、碳酸鈉、福林酚試劑均為分析純，購于成都科隆化學品有限公司。纖維素酶(酶活：10萬U/g，最適溫度50 ℃，最適pH 4.8)為食品級，購于和氏璧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Rise-2006型激光粒度儀，濟南潤之科技有限公司；ZDG型濁度儀，無錫市優(yōu)量智能流量儀表有限公司；Varioskan Flash型熒光酶標儀，美國Thermo公司；GJJ型高壓均質機，上海諾尼輕工機械有限公司；JYL-C012型打漿機，九陽股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理方法和均質條件

將羅望子果肉以固液比1∶11混合浸泡30 min，使羅望子果肉質地變軟利于打漿。然后將果肉和水的混合物一起倒入打漿機中進行打漿，大約1 min后觀察到果漿中沒有果肉顆粒判斷為制漿完成。向制備好的羅望子果漿中加入底物濃度1.5‰的纖維素酶，混合均勻后于50 ℃水解50 min。酶解好的羅望子果漿經(jīng)過300目濾袋粗濾后分裝到飲料瓶中。制備好的羅望子濁汁經(jīng)過水浴平衡20 min后轉移至均質機進料口中，調(diào)節(jié)壓力閥，按照條件對羅望子濁汁進行均質。均質完成的樣品立即水浴冷卻后裝入無菌玻璃瓶中在4 ℃儲存直至分析。在控制進料溫度為50 ℃、均質壓力20 MPa、均質次數(shù)為2次的基礎條件下，改變其中一項均質條件對羅望子濁汁進行處理。選取均質壓力0～30 MPa，進料溫度20～70 ℃，均質次數(shù)0～5次。

1.3.2 濁汁離心沉淀率和上清液濁度的測定

稱量5 mL離心管的質量m1，加入3.5 mL均質后的樣品溶液，稱量離心管和飲料的質量m2，以250 g的離心力離心20 min，取上層清液用蒸餾水稀釋20倍后放入玻璃樣杯中用濁度儀測定濁汁上清液濁度。拭去蓋子、管口及內(nèi)壁上的殘余液體后精確稱量離心管和沉淀的質量m3，按照公式(1)計算離心沉淀率SR，離心沉淀率SR越大，說明飲料的穩(wěn)定性越差。

(1)

1.3.3 激光粒度儀分析

用激光粒度分析儀進行測定，在室溫下吸取一定量的羅望子濁汁加入到以蒸餾水為分散介質中，調(diào)節(jié)遮光比大于0.6，測定羅望子濁汁粒度分布曲線。

1.3.4 總酚的測定

采用Folin-Ciocalteus法[9]，取樣品0.4 mL，加入2 mL稀釋10倍的Folin酚試劑，反應5min后加入10% Na2CO3溶液3 mL，混合均勻后常溫放置1 h，于765 nm處測定OD值，對比相應的沒食子酸標準曲線計算總酚含量。

1.3.5 總黃酮的測定

采用分光光度法，吸取稀釋了2倍的樣品溶液0.3 mL，加入30%的乙醇溶液3.4 mL和0.5 mol/L的NaNO2溶液0.5 mL，6 min后加入0.3 mol/L的AlCl3·6H2O溶液0.15 mL，6 min后在410 nm處測定波長，并對比相應蘆丁標準曲線計算總黃酮含量[9]。

1.3.6 抗氧化能力的測定

利用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力[10-11]評價羅望子濁汁的體外抗氧化能力。

對于DPPH自由基的清除能力，將1 mL混勻后的羅望子濁汁與0.5 mL 0.35 mg/mL DPPH乙醇溶液振動均勻后在暗處反應20 min后在517 nm測量溶液的OD值。

對于ABTS自由基的清除能力，首先將ABTS粉末用蒸餾水溶解為濃度為7 mmol/L的ABTS溶液，再與濃度為140 mmol/L的K2S2O8溶液混合，室溫避光靜置過夜。使用時用0.1 mol/L PBS緩沖液稀釋，要求其在734 nm波長下的OD值為0.70±0.02。取稀釋后的ABTS自由基溶液3.9 mL加入0.1 mL樣品振蕩后在黑暗處靜置10 min后在734 nm處測定OD值。

對于羥自由基清除能力，向試管中依次加入1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液和稀釋10倍的羅望子濁汁樣品，充分混合后迅速轉移到37 ℃水浴鍋中避光反應30 min后在510 nm處測定OD值。

對于不同自由基清除能力的測定，均用蒸餾水替代樣品溶液作為陰性對照，結果表示為羅望子濁汁中抗壞血酸當量。

1.4 統(tǒng)計分析

每組測量實驗重復3次，最終數(shù)據(jù)為平均值，并計算標準偏差。用Microsoft Excel 2013進行基本數(shù)據(jù)處理，用軟件SPSS 21.0進行顯著性分析，采用Origin 8.0制圖。

2 結果與分析

2.1 高壓均質對羅望子濁汁粒度分布的影響

不同高壓均質壓力、進料溫度和均質次數(shù)對羅望子濁汁粒度的影響如圖1所示。所有的樣品均呈現(xiàn)單峰分布。由圖1-A可以看出，未進行均質處理的樣品粒度分布范圍最大。其中，從1～7 μm的顆粒占顆粒總體積的90%以上。隨著均質壓力的提升，羅望子濁汁的粒度分布迅速向低粒度區(qū)域移動。同時還觀察到隨均質壓力的升高，濁汁粒度分布范圍明顯變得集中，當均質壓力達到15 MPa以上時，繼續(xù)提升壓力羅望子濁汁的粒度分布幾乎沒有變化。這表明較大的果肉顆粒經(jīng)過壓力閥時被破碎成較小的顆粒，這種變化規(guī)律與橙汁、番茄汁和菠蘿汁相同[12-14]。當均質壓力到達15 MPa以上時，2 μm以下的顆粒占顆粒總體積90%以上。由圖1-B可以看出，在壓力為20 MPa、均質次數(shù)2次的條件下，溫度的變化對羅望子濁汁的粒度影響不顯著，但是由圖1可以看出40～60 ℃條件下，羅望子濁汁中顆粒的平均粒徑較低，較高的溫度使得濁汁粒度部分增加可能是較高的入口溫度導致蛋白質的凝固[15]。由圖1-C可以看出均質次數(shù)對羅望子濁汁粒度影響顯著，均質1次后，濁汁的粒徑迅速減小，當均質次數(shù)達到2次后，繼續(xù)增加均質次數(shù)無法明顯的減小濁汁的粒度。

A-50℃/0～30 MPa/2次；B-30～70℃/20 MPa/2次；C-50℃/20 MPa/0～5次圖1 不同均質壓力、進料溫度和均質次數(shù)的粒度分布曲線Fig.1 Particle size distribution curves of different homogenizing pressures, feeding temperature and passes number

2.2 高壓均質對羅望子濁汁離心沉淀率與清液濁度的影響

不同條件高壓均質處理對羅望子濁汁離心沉淀率和清液濁度的影響如圖2所示。渾濁型果汁中含有較多的懸浮顆粒，這些懸浮顆粒常常是不溶性的果膠、蛋白質、纖維素和半纖維素，它們通過吸收光線造成了果汁的渾濁。由圖1-A得知，隨著均質壓力的增加濁汁離心沉淀率顯著下降，清液濁度顯著上升。由斯托克斯定律，顆粒的沉降速度與顆粒粒徑成正比，顆粒尺寸越小沉降速度越慢。未均質的樣品顆粒尺寸大，容易在離心過程中沉降下來，因此離心后清液的濁度也較低[16]。隨著均質壓力的增加，果肉中顆粒逐漸降低，所以濁汁的穩(wěn)定性也提高了。但是當均質壓力達到20 MPa后，濁汁離心沉淀率和清液濁度均變得穩(wěn)定，這與濁汁的粒度分布結果相似。由圖1-B可知，適當進料溫度有利于濁汁離心沉淀率的下降和清液濁度的提高，但當進料溫度提高至50 ℃以上時，濁汁離心沉淀率升高且清液濁度下降，這可能是因為70 ℃條件下蛋白質等變性造成顆粒聚集，從而導致濁汁穩(wěn)定性降低。由圖1-C可以看出，2次均質對濁汁的離心沉淀率和清液濁度有顯著的影響，能顯著提高濁汁的穩(wěn)定性。但是當均質次數(shù)超過3次后，濁汁的離心沉淀率上升且清液濁度下降。這可能是因為過多的均質次數(shù)使果汁中顆粒粒徑變小、表面積增大、顆粒之間的相互作用增強，且均質過程中提供大量能量導致了小顆粒快速重新聚集[17-18]。

A-50 ℃/0～30 MPa/2次；B-30～70 ℃/20 MPa/2次；C-50 ℃/20 MPa/0～5次圖2 不同均質壓力、進料溫度和均質次數(shù)條件下離心沉淀率和上清液濁度的變化Fig.2 Changes of centrifugal precipitation rate and turbidity of supernatant at different homogenizing pressure,feeding temperatureand passes number注：不同字母表示不同提取條件間差異顯著(P<0.05),下同

2.3 均質條件對濁汁活性物質及抗氧化活性的影響

均質壓力、進料溫度和均質次數(shù)變化對羅望子濁汁活性物質含量及抗氧化活性的影響如表1所示。對于所有的處理，濁汁中多糖含量與對照組相比均沒有顯著差異，這與BENGTSSON等的研究結果相似[19]。對于均質壓力，較低的均質壓力能顯著提高濁汁總酚含量、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力。15 MPa的均質壓力處理與對照組相比，濁汁總酚含量、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力分別提高了13.45%、10.06%和7.77%。但是對于過高的均質壓力，濁汁黃酮含量、ABTS自由基清除能力和清自由基清除能力與對照組相比均發(fā)生顯著下降。對于進料溫度溫度，隨進料溫度的上升，除多糖含量外所有指標均呈現(xiàn)下降趨勢。當進料溫度達到60 ℃時，總酚含量、黃酮含量、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力與室溫進料相比均下降顯著。對于均質次數(shù)，2次均質有利于濁汁活性物質的溶出，但當均質次數(shù)達到4次，濁汁中總酚含量和黃酮含量顯著降低。

這種現(xiàn)象可能由多種因素決定，一方面，高壓均質減小果汁中懸浮物的粒度，可能使結合狀態(tài)的酚類物質釋放出來，成為游離態(tài)的酚類而被檢測到[20]。但另一方面，由于高壓均質處理激活了濁汁中多酚氧化酶和糖苷酶的活性，使?jié)嶂械牟糠侄喾宇愇镔|降解[21]。且高壓均質過程中的空穴效應可能使得濁汁溶解氧濃度升高，導致了多酚類物質的氧化分解[22]。另外，均質過程中使?jié)嶂瓬囟壬撸赡軐е麦w系內(nèi)的化學反應和物理反應速率加快。

2.4 相關性分析

濁汁活性物質含量與濁汁體外抗氧化活性指標間相關性分析結果如圖3，濁汁多糖含量與3種自由基清除能力間沒有顯著相關性，濁汁總酚含量與DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力間均呈現(xiàn)極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.808和0.679。濁汁黃酮含量與羥自由基清除能力呈現(xiàn)顯著正相關，相關系數(shù)為0.543；濁汁黃酮含量與ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.934和0.581。酚類物質和黃酮類物質被認為具有良好的抗氧化活性，酚類物質和黃酮類物質與3種自由基清除能力的正相關關系說明了它們是影響羅望子濁汁抗氧化能力的重要因素。3種自由基清除能力之間也呈現(xiàn)較好的相關性，說明這3種體外抗氧化活性評價方法能有效地反映濁汁的抗氧化活性。

表1 均質條件變化對羅望子濁汁活性物質含量及抗氧化活性的影響Table 1 Effect of homogenization conditions on the content of active substances and antioxidant activity in turbid juice of tamarind

注：同一列不同小寫字母表示具有顯著性(P<0.05)

圖3 濁汁活性物質含量與濁汁體外抗氧化活性指標間相關性分析結果Fig.3 Results of correlation analysis between the content of active substances in turbid juice and the antioxidant activity indexes in vitro注：*表示在P<0.05水平條件下的相關顯著性；**表示P<0.01水平條件下的相關顯著性

2.5 正交實驗

通過以上實驗結果發(fā)現(xiàn)，適當?shù)木|條件可以提高濁汁穩(wěn)定性且較大程度保留濁汁的活性物質含量，但是過于強烈的均質條件會導致濁汁穩(wěn)定性和活性物質含量下降。為在盡可能提高濁汁穩(wěn)定性的前提條件下保留濁汁較高的抗氧化活性，選擇進料溫度水平為40、50和60 ℃，均質壓力水平為15、20和25 MPa，均質壓力水平為1、2和3次，以濁汁離心沉淀率和上清液濁度為評判指標進行正交實驗。

由表2可知，離心沉淀率及上清液濁度均呈現(xiàn)相似的結果，各因素對濁汁離心沉淀率及上清液濁度影響的主次順序為均質次數(shù)>均質壓力>進料溫度，得到最優(yōu)提取工藝為A2B3C2，即：進料溫度50 ℃、均質壓力25 MPa、均質次數(shù)2次。對最優(yōu)均質條件進行3次重復實驗驗證，在此均質條件下，羅望子濁汁離心沉淀率為1.18%、上清液濁度為435.50 NTU。

3 結論

高壓均質處理可以顯著減小羅望子濁汁中顆粒的粒度，隨著均質壓力和均質次數(shù)的增加，濁汁粒度分布向低粒徑區(qū)域移動。適當?shù)木|條件可以提高羅望子濁汁的穩(wěn)定性和抗氧化能力，過多的均質次數(shù)或進料溫度不利于羅望子濁汁的穩(wěn)定性，過高的進料溫度和均質次數(shù)甚至會導致羅望子濁汁總酚和黃酮含量低于對照組(P<0.05)，但是濁汁多糖含量對均質條件的變化不敏感。相關性分析表明，濁汁中總酚含量和黃酮含量與濁汁DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力呈現(xiàn)較好的相關性。通過正交實驗對均質工藝進行優(yōu)化，最優(yōu)工藝條件為進料溫度50 ℃、均質壓力25 MPa、均質次數(shù)2次，在此均質條件下，羅望子濁汁離心沉淀率為1.18%、上清液濁度為435.50NTU。

表2 正交實驗設計及極差分析結果Table 2 Results of orthogonal experimental design and range analysis