枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵螺旋藻渣產(chǎn)抑菌活性的工藝

付云，趙謀明, 2，盧美杉，余煉，劉小玲*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣西 南寧， 530004)2(華南理工大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州， 510000)

螺旋藻是工業(yè)化規(guī)模養(yǎng)殖的微藻之一[1]，其蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全，被譽為天然食物之冠[2]。螺旋藻渣是螺旋藻粉生產(chǎn)過程中沉積物，其蛋白質(zhì)含量占其干重的60%左右。目前大部分螺旋藻渣被以污水排放的形式進行處理，小部分作為水產(chǎn)飼料低價銷售[3]。藻渣作為一種蛋白質(zhì)資源不僅沒有被充分利用，反而成為了螺旋藻生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，螺旋藻渣資源開發(fā)應(yīng)用不僅可以提高螺旋藻的經(jīng)濟價值，降低企業(yè)生產(chǎn)成本，同時也為廢棄蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用提供了一條新途徑。然而，關(guān)于螺旋藻渣資源的回收利用相關(guān)的研究卻鮮有報道。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種需氧型革蘭氏陽性菌，分泌蛋白酶能力強，具有公認(rèn)的安全特性[4]。大量研究表明，該菌次級代謝產(chǎn)物中的抗菌肽如桿菌肽[5]、表面活性素(Surfactin)[6]和伊枯草菌素(Iturin)[7]等對植物病原菌和食品病原菌都具有不同程度的抑制作用[8]。枯草芽孢桿菌YA215是本研究團隊從海洋中分離出的1株高產(chǎn)中性蛋白酶菌株，可適應(yīng)海水和半海水的生長環(huán)境及基質(zhì)，繁殖能力強，抗逆性強。如能通過枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵螺旋藻渣，提高螺旋藻的抑菌性，則可將發(fā)酵后的螺旋藻應(yīng)用于飼料，提高動物的抗病性，從而有效提高藻渣的價值。為此，本研究探究發(fā)酵液螺旋藻渣、碳源、無機鹽的添加量，接種量和發(fā)酵時間等因素對枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵螺旋藻渣效果的影響，通過對發(fā)酵產(chǎn)物中性蛋白酶活、多肽含量及對金黃色葡萄球菌抑菌效果等相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測，優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得抑菌作用突出的發(fā)酵產(chǎn)物，為科學(xué)合理開發(fā)利用螺旋藻渣提供技術(shù)支撐，同時也為后續(xù)研究枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵產(chǎn)物中抗菌物質(zhì)及抑菌機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC14519，中國普通微生物菌種保藏管理中心提供；實驗菌：枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisYA215)，本課題組研究人員從北部灣海洋中分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌基礎(chǔ)(luria-bertani，LB)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10。制備固體培養(yǎng)基時添加20 g/L瓊脂粉，pH 7.0。

1.1.3 試劑

螺旋藻渣(冷鏈運輸后快速凍結(jié)放于-20 ℃?zhèn)溆?，廣西生巴達(dá)生物科技有限公司。

NaOH、NaCl、CuSO4、硫酸銅和葡萄糖均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；尼薩普林，丹尼斯克(中國)有限公司；福林酚、果糖，北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6100紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；CR21N高速冷凍離心機，日立公司；SUNRISE酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；Sherlock微生物計數(shù)儀，美國MIDI公司；ZQZY-85CS振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與發(fā)酵劑制備

將保存于-80 ℃冰箱內(nèi)的BacillussubtilisYA215菌種接種于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。再將活化好的菌種挑單菌落，接種于250 mL含有100 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，200 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，得到用于接種藻渣培養(yǎng)的發(fā)酵劑(107～108CFU/mL)。

1.3.2 單因素實驗設(shè)計

取50 mL活化后的BacillussubtilisYA215菌液(107～108CFU/mL)，按一定接種量接種于不同添加量的藻渣溶液中并添加一定量的碳源、NaCl，最后用無菌水定容到1 L，在37 ℃下 200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)一定時間，培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取其發(fā)酵上清液并測定上清液中的中性蛋白酶酶活、多肽含量及對金黃色葡萄球菌抑菌率。實驗考察的單因素及其水平如表1所示。進行每個單因素實驗時，其他因素維持恒定見表1。進行下一組單因素時，選擇前一因素最佳水平進行。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計法，對螺旋藻渣添加量、果糖添加量、NaCl添加量、接種量和發(fā)酵時間5個因素進行探究，篩選出顯著影響發(fā)酵上清液抑菌活性的因素。每個試驗因素均取高(1)、低(-1)兩水平，用來考察試驗過程中的隨機誤差。以發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌率作為響應(yīng)值，Plackett-Burman設(shè)計因子水平及編碼如表2所示。

表1 發(fā)酵條件單因素試驗因素水平表Table 1 different factors and levels of fermentation condition

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素及編碼水平Table 2 Factor and code level of Plackett-Burmanexperimental design

1.3.4 正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素及PB試驗所篩選出的對發(fā)酵上清液抑菌活性有顯著影響的因素進行L9(33)正交優(yōu)化試驗，其他影響因素條件為在裝液量1 L，發(fā)酵溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，果糖添加量為10 g/L，NaCl添加量為10 g/L。以發(fā)酵上清液中的中性蛋白酶活力、多肽含量及對金黃色葡萄球菌抑菌率為指標(biāo)，確定BacillussubtilisYA215發(fā)酵螺旋藻渣的最佳發(fā)酵條件，各因素和各水平的選擇,如表3所示。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels of used in orthogonal experiment

1.3.5 優(yōu)化與對照實驗

正交試驗得到的最優(yōu)組合與僅含10 g/L藻渣底物的發(fā)酵液、LB為底物的發(fā)酵液做對照試驗。檢測指標(biāo)主要包括發(fā)酵上清液的中性蛋白酶活力、多肽含量、金黃色葡萄球菌抑菌率及抑菌圈直徑大小。

1.3.6 蛋白酶活性的測定

參照GB/T 23527—2009所示[9]，取BacillussubtilisYA215發(fā)酵上清液稀釋一定倍數(shù)，采用福林酚法測定中性蛋白酶活力。

1.3.7 多肽含量的測定

取2 mL發(fā)酵上清液，加入10%三氯乙酸2.0 mL，混勻，靜置10 min，5 000 r/min離心15 min，取0.5 mL上清液于另一試管中，再加入2 mL雙縮脲試劑，混勻后靜置15 min，3 000 r/min離心15 min后，取上清液于540 nm處測吸光度值，以加0.5 mL蒸餾水和2.0 mL雙縮脲試劑作空白[10]。

1.3.8 抑菌活性的測定

1.3.8.1 抑菌率測定

吸取100 μL指示菌菌懸液(108～109CFU/mL，下同)于100 mL LB培養(yǎng)液中，實驗組添加10 mL枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵上清液，空白組不添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵濾液，進行抑菌試驗。培養(yǎng)12 h后，測定菌液在600 nm波長下吸光度值。通過實驗組與空白組的菌液濃度計算出抑菌率[11-12]如公式(1)所示。

(1)

式中：A1，空白組吸光度值；A2，實驗組吸光度值。

1.3.8.2 抑菌圈直徑測定

LB瓊脂培養(yǎng)基溶解冷卻至45 ℃左右，無菌條件下接入1%指示菌菌懸液，混勻倒入置有1 mL槍頭的平板中，凝固后將槍頭取出，孔內(nèi)加入100 μL發(fā)酵上清液，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌并記錄抑菌圈直徑大小(mm)[13-15]。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗均進行3次平行實驗，試驗數(shù)據(jù)均采用Minitab 15軟件、IBM SPSS Statistics 19與Origin 9.1進行數(shù)據(jù)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響藻渣發(fā)酵液產(chǎn)物活性的因素

2.1.1 螺旋藻渣添加量的選擇

藻渣添加量對中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率的影響如圖1所示。圖1-a表明，螺旋藻渣添加量在10～15 g/L，隨著藻渣的增加，微生物營養(yǎng)充足，故發(fā)酵液中性蛋白酶酶活升高，蛋白質(zhì)水解速度加快，多肽含量增加，在藻渣添加量達(dá)到15 g/L時，中性蛋白酶活和多肽含量達(dá)到最高，分別為68.2 U/mL和6.52 mg/mL；藻渣添加量在15～30 g/L時，中性蛋白酶活和多肽含量均呈下降趨勢，由于枯草芽孢桿菌是好氧微生物，過高的藻渣添加量使三角瓶內(nèi)溶氧量不足，菌體產(chǎn)酶量減少，酶活降低，多肽含量減少[16]。由圖1-b可知，藻渣添加量為15 g/L時，發(fā)酵上清液對S.aureus的抑菌率顯著高于其他添加量(P<0.05)，因此螺旋藻渣添加量選擇15 g/L為宜。

a-酶活；b-抑菌率圖1 藻渣添加量對中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率的影響Fig.1 Effects of spirulina residue addition amount on neutral protease activity and poly peptide content and bacteriostasis rate注：各數(shù)據(jù)間標(biāo)注不同字母之間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.1.2 碳源的選擇

枯草芽孢桿菌YA215在15 g/L螺旋藻渣培養(yǎng)液中，分別添加質(zhì)量濃度為10 g/L的不同碳源后發(fā)酵24 h，其上清液中性蛋白酶活、多肽含量如圖2所示。由圖2可知，可溶性淀粉為碳源時，其發(fā)酵上清液的中性蛋白酶活、多肽含量最低，且比無碳源添加的發(fā)酵上清液還低，其次為蔗糖，這可能是由于枯草芽孢桿菌YA215不具有分解糖苷鍵的能力，無法有效利用聚合糖所致[17]。4種單糖中，果糖最有利于促進枯草芽孢桿菌YA215分泌中性蛋白酶，并進而分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的多肽含量。蛋白酶酶活與其發(fā)酵上清液多肽含量呈同步遞增的趨勢。因此，在藻渣液中增加適量的單糖，尤其是果糖，可獲得更高酶活和多肽含量。

圖2 碳源種類對中性蛋白酶活和多肽含量的影響Fig.2 Effects of carbon source on neutral proteaseactivity and poly peptide content

2.1.3 果糖添加量的選擇

由圖3-a可知，果糖添加量在5～10 g/L時，中性蛋白酶活和多肽含量均隨果糖添加量的增加而增大；繼續(xù)增大果糖添加量，中性蛋白酶活和多肽含量均呈下降趨勢。這可能是因為適當(dāng)?shù)墓翘砑恿繉莶菅挎邨U菌的生長具有促進作用， 然而果糖添加過多后，嚴(yán)重加速菌體呼吸作用，導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶氧不足，使枯草芽孢桿菌的生長和產(chǎn)酶受到抑制[18]。由圖2、圖3-b可知，果糖添加量為10、15 g/L時，發(fā)酵上清液對S.aureus的抑菌率沒有顯著性差異(P>0.05)。因此，綜合發(fā)酵上清液中中性蛋白酶活、多肽含量和對S.aureus的抑菌率考慮，果糖添加量選擇10 g/L。

a-酶活；b-抑菌率圖3 果糖添加量對中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率的影響Fig.3 Effects of fructose addition amount on neutral proteaseactivity and poly peptide content and bacteriostasis rate

2.1.4 NaCl添加量的選擇

無機鹽可以為微生物提供礦質(zhì)元素、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH和滲透壓等。圖4-a表明，發(fā)酵上清液中性蛋白酶活和多肽含量隨NaCl的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在NaCl添加量為10 g/L時，發(fā)酵上清液中性蛋白酶活和多肽含量達(dá)到最大值；當(dāng)NaCl添加量超過10 g/L時，中性蛋白酶活和多肽含量急劇降低，這是因為鹽濃度增大使微生物處于高滲透壓環(huán)境，導(dǎo)致微生物脫水死亡[19]。由圖4-b可知，NaCl添加量為10、15 g/L時，發(fā)酵上清液對S.aureus的抑菌率沒有顯著性差異(P>0.05)。因此，綜合考慮下，NaCl添加量選擇10 g/L。

a-酶活；b-抑菌率圖4 NaCl添加量對中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率的影響Fig.4 Effects of NaCl addition amount on neutral proteaseactivity and poly peptide content and bacteriostasis rate

2.1.5 接種量的選擇

接種量對發(fā)酵上清液中性蛋白酶活、多肽含量和S.aureus的抑菌率如圖5所示。隨著接種量的增加，發(fā)酵上清液中性蛋白酶活、多肽含量和對S.aureus的抑菌率均呈上升趨勢，在接種量為100 mL/L時各項指標(biāo)達(dá)到最大值，之后抑菌率趨于平穩(wěn)，當(dāng)接種量在100～150 mL/L之間時，發(fā)酵上清液對S.aureus的抑菌率均無顯著性差異(P>0.05)，而中性蛋白酶活和多肽含量呈現(xiàn)下降趨勢，這是因為當(dāng)接種量過大時，微生物大量生長繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵后期培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)不足，部分微生物死亡或利用酶解出的小分子多肽用于自身生長發(fā)育[20-21]所致。因此，接種量選擇100 mL/L為最佳。

a-酶活；b-抑菌率圖5 接種量對中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率的影響Fig.5 Effects of inoculum on neutral protease activity andpoly peptide content and bacteriostasis rate

2.1.6 發(fā)酵時間的選擇

圖6-a表明，在24～48 h，發(fā)酵上清液中性蛋白酶活和多肽含量隨發(fā)酵時間的增加而逐漸升高，在發(fā)酵48 h時中性蛋白酶活和多肽含量達(dá)到最高，分別為157.1 U/mL，16.3 mg/mL。而隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，中性蛋白酶活和多肽含量均呈下降趨勢，其原因可能是當(dāng)菌體數(shù)量積累到一定程度時，培養(yǎng)液中營養(yǎng)不足，微生物需要利用酶解出的小分子多肽用于生長繁殖[22]，也可能是因為發(fā)酵液中的大量蛋白酶繼續(xù)將產(chǎn)生的多肽水解成氨基酸，導(dǎo)致多肽含量持續(xù)下降[23]。

由圖6-b可知，發(fā)酵時間為24、36 h時，發(fā)酵上清液對S.aureus的抑菌率顯著高于其他發(fā)酵時間。因此，兼顧中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率3指標(biāo)的考慮，選擇發(fā)酵時間為36 h。

a-酶活；b-抑菌率圖6 發(fā)酵時間對中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率的影響Fig.6 Effects of fermentation time on neutral protease activityand poly peptide content and bacteriostasis rate

2.2 Plackett-Burman試驗確定影響發(fā)酵的顯著因素

Plackett-Burman(PB)試驗結(jié)果如表4所示，采用Minitab 15軟件對表4試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理及效應(yīng)分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，接種量和發(fā)酵時間對抑菌率具有極顯著性影響(P<0.01)，螺旋藻渣添加量對抑菌率具有顯著性差異(P<0.05)，而果糖和NaCl對抑菌率無顯著性影響(P>0.05)。因此，選擇螺旋藻渣添加量、接種量和發(fā)酵時間等3個顯著影響因素進行進一步的發(fā)酵優(yōu)化實驗。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計和結(jié)果Table 4 Results of Plackett-Burman experimental design

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計回歸各因子效應(yīng)分析Table 5 Analyses of Plackett-Burman experimental design

2.3 正交試驗優(yōu)化藻渣發(fā)酵條件

在Plackett-Burman(PB)試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(33)正交試驗以確定BacillussubtilisYA215發(fā)酵螺旋藻渣的最佳條件，試驗結(jié)果，如表6所示。由表6可知，影響B(tài)acillussubtilisYA215中性蛋白酶活的各因素順序是A>C>B；影響多肽含量的各因素順序是A>B>C；影響發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌抑菌率的各因素順序是A>B>C。

表6 正交試驗因素水平表Table 6 Results of orthogonal experimental

以中性蛋白酶活、多肽含量、抑菌率為指標(biāo)時，最優(yōu)培養(yǎng)基的組合分別：A2B3C3、A2B1C3、A2B3C2。由于試驗設(shè)計方案都不包括最優(yōu)組合，故需做驗證試驗進行對比，結(jié)果如表7所示。

表7 Bacillus subtilis YA215發(fā)酵培養(yǎng)基驗證結(jié)果Table 7 Verification results for the Bacillus subtilis YA215fermentation culture

表7中在最佳組合A2B1C3條件下發(fā)酵，多肽含量為16.8 mg/mL，對S.aureus的抑菌率為64.6%，優(yōu)于組合A2C3B3和A2B3C2，中性蛋白酶活為147.4 U/mL，略低于組合A2C3B3和A2B3C2。由于多肽是枯草芽孢桿菌重要發(fā)酵產(chǎn)物，且與抑菌作用的產(chǎn)生有緊密聯(lián)系[5]，故選擇A2B1C3為最佳組合，即藻渣添加量為15 g/L，接種量75 ml/L，發(fā)酵時間48 h。

2.4 優(yōu)化與對照試驗結(jié)果分析

由表8可知，藻渣發(fā)酵條件優(yōu)化后，與優(yōu)化前10 g/L藻渣培養(yǎng)液相比，中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率分別提高119.3%，217.0%，196.3%；與LB培養(yǎng)基相比，中性蛋白酶活、多肽含量和抑菌率分別提高65.1%，127%，92.8%。優(yōu)化前，LB培養(yǎng)基和10 g/L藻渣培養(yǎng)基發(fā)酵上清液對S.aureus作用產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小(抑菌圈直徑=外圈直徑)分別為12.8 mm和12.1 mm，優(yōu)化后，最佳培養(yǎng)基發(fā)酵上清液產(chǎn)生的抑菌圈直徑為15.3 mm，接近陽性對照尼薩普林產(chǎn)生的抑菌圈16.6 mm。張雯等[11]利用枯草芽孢桿菌BS08發(fā)酵無菌濾液進行抑菌圈實驗的測定，其抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小也僅10 mm。由此可見，優(yōu)化后的培養(yǎng)基不僅能顯著提高螺旋藻渣的利用率，也能產(chǎn)生更多的抑菌活性物質(zhì)。

表8 Bacillus subtilis YA215發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化對照Table 8 The comparison of the optimation and controlexperiment for the Bacillus subtilis YA215 fermentationculture

注：各數(shù)據(jù)同列間不同字母符號存在顯著性差異(P<0.05)

3 結(jié)論

本研究通過對枯草芽孢桿菌YA215發(fā)酵螺旋藻渣的工藝條件進行優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵條件。即pH 7.0的1 L初試發(fā)酵底物中，螺旋藻渣添加量15 g/L，果糖添加量10 g/L，NaCl添加量10 g/L，YA215的接種量75 ml/L，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間48 h，轉(zhuǎn)速200 r/min時，其發(fā)酵產(chǎn)物中的中性蛋白酶活、多肽含量及對金黃色葡萄球菌抑菌率比常規(guī)LB培養(yǎng)基分別提高了65.1%，127%，92.8%，為今后進一步研究枯草芽孢桿菌YA215對螺旋藻渣資源轉(zhuǎn)化和利用提供了實驗依據(jù)。然而，本研究采用的三角錐形瓶搖床發(fā)酵，由于三角瓶空間有限，螺旋藻渣發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方和發(fā)酵條件是否具備放大穩(wěn)定性還需要進一步驗證，本研究還有待結(jié)合實際生產(chǎn)進一步考察影響因素、擴大實驗規(guī)模，優(yōu)化生產(chǎn)條件。