云南乳餅中乳酸菌的篩選及其功能活性

劉江，程群，王振興，孫健，何雪梅，劉大群，周貴七，熊智，張雪春*

1(西南林業大學 生命科學學院，森林食品研究院，云南 昆明，650224)2(廣西農業科學院農產品加工研究所，廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室，廣西 南寧，530007)3(浙江省農業科學院，食品科學研究所，浙江 杭州，310021)

近年來，我國人群中以高膽固醇、甘油三酯水平為特點的血脂異?；疾÷蚀蠓仙瑢е滦难芗膊“l病率明顯上升[1]。因此，從豐富的食物資源中發現、篩選具有降血脂特性的功能因子具有重要意義。

乳酸菌是人體腸道中重要的益生菌，對維持宿主腸道的微生態平衡和提高其免疫功能有重要作用[2]。在生物醫學、農業等領域，乳酸菌具有降低膽固醇[3]、抗氧化[4]、抗癌[5]、抗病毒[6]、抗真菌[7]、抗感染[8]、緩解炎癥性腸病[9]等作用，有安全、高效的獨特優勢。同時乳酸菌是各種發酵食品的重要組成部分，在肉制品、乳制品、果蔬以及飲料市場等食品領域有廣泛應用，具有改善食品營養價值和風味[10]、抑制食品中腐敗菌等有害微生物的生長和降解有害物質[11]、延長食品保質期[12]等作用。但是乳酸菌進入人體后，受到胃腸環境、抗生素和其他微生物等因素的影響，最終的生物活性損失較大，需要篩選具有良好環境適應能力的菌株以保證其生物有效性。

乳餅是云南傳統發酵食品，也是乳酸菌的重要資源。其以牛、羊乳經發酵制作而成，口感獨特美味，具有較高的營養價值[13]。在長期的自然馴化中，不同地域的自然環境、原料以及加工工藝的差異，造成了云南乳餅中豐富多樣性的乳酸菌資源。但目前對云南乳餅中乳酸菌的研究主要集中在菌種的分離、鑒定、發酵能力評估和優化等方面[14-16]，對于其功能活性和應用的研究鮮有報道。

因此本文選取云南代表性地區的乳餅為原料，以降解膽固醇及甘油三脂能力、耐酸耐膽鹽能力、耐藥性和抑菌能力為指標，篩選得到降血脂和環境適應能力較好的乳酸菌菌株并進行鑒定，同時比較其與商業化乳酸菌菌株的體外抗氧化能力。旨在篩選出具有優良降血脂特性的乳酸菌菌株，促進乳酸菌在生產實踐中的應用，同時為我國傳統發酵食品資源的挖掘和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

乳餅在2019年3月分別購于云南省大理白族自治州雙廊鎮、昆明市路南彝族自治縣、曲靖市陸良縣，均為羊乳為原料，經當地農戶采用自然發酵制作。樣品采集在無菌離心管中，置于冰塊中運輸到實驗室后于-80℃儲存。

1.1.2 試劑

甘油三酯(TG)試劑盒，南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、胃蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；膽鹽、膽固醇，上海瑞永生物科技有限公司；2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，上海阿拉丁生化科技有限公司；BBI EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；FeCl3、硫酸鐵銨等常規試劑，均購于天津市大茂化學試劑有限公司。

1.1.3 試驗菌株

保加利亞乳桿菌GDM1.155、干酪乳桿菌GDM1.159、嗜熱鏈球菌GDM1.83、植物乳桿菌GDM1.140，廣東省微生物菌種保藏中心；大腸桿菌ATCC80739、金黃色葡萄球菌A1、銅綠假單胞桿菌PAO1，西南林業大學西南地區生物多樣性保育實驗室。

1.1.4 儀器與設備

SHZ-82恒溫振蕩器，常州智博瑞儀器制造有限公司；XINYI-ⅡD超聲波粉碎機，寧波新藝超聲設備有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；UV-1000紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科技儀器有限公司；酶標儀美國(SpectraMax Plus 384)；DW-HL218超低溫冷凍儲存箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；DH6000BⅡ電熱恒溫培養箱，上海雙旭電子有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

從采集到的樣品中心部分取10 g放入無菌研缽中研碎后，加入0.85%無菌生理鹽水振蕩30 min，制備成懸液，梯度稀釋后均勻涂布到MRS、M17固體乳酸菌選擇培養基上，分離樣品中桿狀及球狀乳酸菌[17]。于恒溫培養箱中37℃培養36 h，挑取平板上具有溶鈣圈的菌落進行劃線直至獲得純菌落。對分離純化后的菌落進行革蘭氏染色，在生物顯微鏡下進行鏡檢，并進行接觸酶等生理生化試驗[18]。挑取經初步鑒定后的純菌落于MRS及M17液體培養基中，37℃培養36 h后用甘油保藏法進行保藏，-80℃超低溫冰箱貯藏備用。

1.2.2 體外降解膽固醇能力的測定

將分離得到的乳酸菌按照4%的接種量接種至膽固醇培養基[19](膽固醇培養基：將膽固醇膠束溶液加入到MRS及M17液體培養基中，使培養基中膽固醇最終質量濃度為0.1 g/L；所述膽固醇膠束中含有膽固醇0.1 g、吐溫-80 1.0 mL、蔗糖脂肪酸酯0.1 g、冰醋酸5.0 mL，水浴加熱溶解。調pH至6.5±0.2，并在121℃下高壓滅菌15 min，冷卻備用)中，37℃培養36 h后，吸取培養液0.2 mL，加入4.8 mL無水乙醇旋渦振蕩混勻，靜置5 min后再次振蕩混勻，4 000×g離心10 min，取2 mL上清液用于膽固醇的測定，膽固醇的測定采用硫酸鐵銨比色法[20]，測定OD560 nm值，以未接菌的膽固醇培養基作為對照，膽固醇降解率計算如公式(1)：

(1)

1.2.3 體外降解甘油三酯能力的測定

將分離得到的乳酸菌按照4%的接種量接種至甘油三酯培養基[21](甘油三酯培養基：將2%的聚乙烯醇水溶液與植物油按3∶1混合，用高速分散均質機處理后作為甘油三酯的來源，并按照4%的用量加入MRS及M17液體培養基中，調pH至6.5±0.2，121℃高壓滅菌15 min，冷卻備用)中，37℃培養36 h后，4 000×g離心10 min，取上清液用于甘油三酯含量測定，利用甘油三酯試劑盒測定培養液中甘油三酯的含量。以未接菌的甘油三酯培養基作為對照。甘油三酯降解率計算如公式(2)、(3)所示：

(2)

(3)

1.2.4 乳酸菌耐酸能力的測定

將分離得到的乳酸菌按4%的接種量接種到MRS及M17液體培養基中，37℃培養36 h后，12 000×g離心10 min收集菌體，用滅菌的去離子水將菌體洗滌2次后懸浮，并用分光光度計測定其濁度，使其OD560 nm為0.8, 4℃冰箱冷藏備用。

使用96孔板法測定其耐酸能力[22]，具體方法操作為取150 μL菌懸液及100 μL pH 3.0的模擬胃液(模擬胃液：在緩沖液制備模擬胃液，所述緩沖液中含有NaCl 2.05 g/L，KH2PO40.60 g/L，CaCl20.11 g/L和KCl 0.37 g/L，用1.0 mol/L的HCl調pH至3.0，并在121℃下高壓滅菌15 min。使用前，加入0.22 μm濾器過濾除菌的胃蛋白酶，使其最終濃度為0.3%，4℃冰箱冷藏備用)加入96孔無菌酶標板中，37℃培養16 h；分別在0 h和16 h測定其OD610 nm值，計算其存活率如公式(4)：

(4)

1.2.5 乳酸菌耐膽鹽能力的測定

選擇在pH 3.0的模擬胃液中存活率較高的乳酸菌，檢測其在不同膽鹽濃度下的耐受性。將150 μL菌懸液及100 μL含3、5、10 g/L膽鹽的MRS和M17液體培養基[23](將牛膽鹽加入MRS及M17液體培養基中，使其膽鹽質量濃度分別為1、3和5 g/L，調pH至6.5±0.2，121℃高壓滅菌15 min，冷卻備用)加入96孔無菌酶標板中，37℃培養16 h；分別在0和16 h測定其OD610 nm值，計算其存活率如公式(5)：

(5)

1.2.6 乳酸菌致病菌抑制能力的測定

采用96孔板法[24]測定乳酸菌對致病菌的抑制作用。取100 μL含有致病性大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌及金黃色葡萄球菌的培養基，添加到含150 μL乳酸菌無細胞提取液的96孔無菌酶標板中，37℃培養24 h后，酶標儀測定OD580nm值，以生理鹽水代替乳酸菌無細胞提取液為對照組。計算乳酸菌的抑菌率如公式(6)所示：

遼寧省大連市西崗區市場監督管理局自2014年9月組建以來，全局上下堅決貫徹執行黨中央、國務院關于加強食品藥品安全工作的決策部署，圍繞堅持“四個最嚴”，落實“四有兩責”，創新求實，勇于在各項重大改革和監管任務中挑重擔、當排頭，主要工作指標不斷取得突破性進展，較好地保障了轄區群眾飲食用藥安全。先后獲得“大連市精神文明建設先進單位”“西崗區先進黨委”等榮譽稱號。

(6)

1.2.7 乳酸菌耐藥性的測定

采用藥敏紙片法[25]測定乳酸菌對抗生素的敏感性，選取青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、環丙沙星、復方新諾明及氯霉素等常用且對細菌作用位點不同的抗生素為測試對象，取0.2 mL的乳酸菌菌液均勻涂布于固體MRS及M17培養基上，后貼放標準藥物紙片，37℃培養36 h，然后測量并記錄抑菌圈的直徑，根據美國臨床和試驗室標準化研究所(CLSI)制定的《抗菌藥物敏感性試驗執行標準》(2010年版)判定乳酸菌對抗生素的耐藥性。

1.2.8 乳酸菌種屬的鑒定

利用DNA提取試劑盒提取乳酸菌基因組DNA，將提取的乳酸菌基因DNA作為16S rDNA-PCR的模板進行擴增，電泳檢測擴增產物后，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，將測序結果通過BLAST程序與GenBank基因庫進行在線比對以確定乳酸菌種屬。

1.2.9 乳酸菌抗氧化能力的測定

1.2.9.1 乳酸菌無細胞提取液的制備

根據AFIFY等[26]方法并進行略微修改，菌株以MRS培養基在37℃培養24 h，后5 000×g離心15 min，收集菌體，用無菌水洗滌2次后調整菌數至1×109/mL。將菌懸液冰浴超聲波破碎，10 000×g離心20 min，收集上清液，為乳酸菌無細胞提取液。

1.2.9.2 清除ABTS自由基能力的測定

根據KAVITA等[27]方法并進行略微修改，取100 μL乳酸菌無細胞提取液加入96孔酶標板，然后加200 μL ABTS工作液(5.0 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液，加入88.0 μL濃度為140 mmol/L的過硫酸鉀，在室溫下置于暗處反應12 h，形成ABTS儲備液。在波長734 nm處，用95%的甲醇將ABTS儲備液稀釋至吸光值為0.70±0.02)，室溫反應5 min后于734 nm測吸光值(As)，以Vc和BHT為陽性對照，以70%甲醇代替ABTS溶液的反應體系為樣品空白組(Ab)，以70%甲醇代替無細胞提取液的反應體系為控制組(Ac)，所有樣品測定3次平行，ABTS自由基清除率的計算如公式(7)：

(7)

1.2.9.3 清除DPPH自由基能力的測定

根據KAVITA等[27]方法并進行略微修改，取150 μL乳酸菌無細胞提取液與150 μL DPPH甲醇溶液于96孔酶標板上混合，避光室溫反應30 min后，于517 nm測吸光值(As)，以VC和BHT為陽性對照，以70%甲醇代替DPPH甲醇溶液的反應體系為樣品空白組(Ab)，以70%甲醇代替無細胞提取液的反應體系為控制組(Ac)，所有樣品測定3次平行，DPPH自由基清除率的計算如公式(8)：

(8)

1.2.9.4 鐵還原能力的測定

根據韓雪等[28]方法并進行略微修改，準確移取50 μL的乳酸菌無細胞提取液于酶標板中，加入250 μL TPTZ工作液(由10 mmol/L的TPTZ溶液；20 mmol/L的FeCl3溶液；pH 3.6的乙酸緩沖液組成)，迅速搖勻后，37 ℃反應10 min，于波長593 nm處測定吸光度值，以FeSO4為標準繪制標準曲線，計算相同吸光值下乳酸菌無細胞提取液的當量濃度，記為鐵還原能力(ferric reducing ability of plasma)，單位為μmol FeSO4/mL樣品，所有樣品測定3次平行。

1.3 數據處理

每組參數均設置3組重復，實驗數據均以平均值±標準差的形式表示，采用SPSS Statistics 19軟件進行差異顯著性分析，并由Origin 7.5軟件繪制實驗結果圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離結果

對采集到的樣品進行分離純化試驗，通過革蘭氏染色鏡檢及接觸酶實驗，初步確認從中分離到149株乳酸菌，根據其來源及培養基依次命名為“S-”“D-”“L-”“MS-”“MD-”“ML-”系列。經傳代培養后，于-80 ℃冰箱保藏備用。

2.2 乳酸菌體外降解膽固醇及甘油三酯能力的測定

149株乳酸菌的體外降膽固醇及甘油三酯能力結果如表1所示。

由表1可知，分離純化得到的149株乳酸菌種，其中119株乳酸菌膽固醇降解率低于35.00%，甘油三脂降解率低于10.00%，故不再表中體現；有14株乳酸菌降解膽固醇及甘油三酯綜合能力較強，降解率均分別大于38.00%及24.00%；其中D16、S41、ML36的膽固醇降解率顯著大于其他菌株；菌株D16的膽固醇降解率及甘油三酯降解率綜合來看最高，分別為62.22%及37.89%。陳依婷從天然發酵食品中分離篩選出的2株乳酸菌，其膽固醇降解率分別為35.33%和33.53%[29]。馬長路等[30]從酸菜中分離得到乳桿菌的膽固醇降解率最高為52.84%。相比之下，菌株D16的膽固醇降解率及甘油三酯降解率較高，有良好的體外降血脂的功效。

表1 乳酸菌體外降解膽固醇及甘油三酯的實驗結果Table 1 The ability of lowering cholesterol and triglycerides by lactic acid bacteria

注：同一列不同小寫字母上標表示差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.3 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測定

乳酸菌作為腸道益生菌，必須具有相對好的耐酸性及耐膽鹽能力，才能在胃和小腸前段存活。以體外降膽固醇及降甘油三酯能力為指標，篩選得到14株乳酸菌，評估其耐酸耐膽鹽能力，實驗結果見表2。

表2 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力實驗結果Table 2 The ability of tolerance of bile-salt and low pH by lactic acid bacteria

結果表明，14株菌株中，有6株菌株在pH 3.0的人工胃液及膽鹽濃度為1、3和5 g/L的培養基中培養16 h存活率分別大于60%、35%、30%及25%其中在pH 3.0的人工胃液中存活率大于85%，且在1、3和5 g/L膽鹽含量的培養基中存活率分別大于82%、60%及45%。通常情況下，人體胃液pH為2～3；人體腸道膽鹽濃度范圍為0.03%～0.3%，乳酸菌在此pH和膽鹽濃度內若能有較高的存活率，則表明菌株對酸和膽鹽有一定的耐受性。而菌株D16的在pH=3的人工胃液及膽鹽質量濃度為1、3、5 g/L的培養基中存活率分別為87.29%、82.36%、81.41%及79.26%，說明菌株D16對酸及膽鹽有很好的耐受能力。

2.4 乳酸菌致病菌抑制能力的測定

乳酸菌作為人體腸道中的重要有益微生物，可以通過產生短鏈脂肪酸、乳酸、甲酸、細菌素、過氧化氫及小分子肽類等一系列代謝產物來拮抗腸道致病菌[31]，采用96孔板法檢測2.3所述5株乳酸菌的致病菌抑制能力，結果如表3所示。

表3 乳酸菌對3種致病菌的抑制作用 單位：%

結果表明，6株乳酸菌均有一定的致病菌抑制能力，其中D16及MD11對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌3種致病菌均有較好的抑制作用；菌株D16對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌的抑制能力較強，抑菌率分別為54.50%、48.82%和62.75%，這與路則寶等[32]的研究相似。

2.5 乳酸菌耐藥性的測定

通過對益生菌進行藥敏性測定，可避免耐藥基因由于益生菌的廣泛使用而傳播。由表4可知，6株乳酸菌對頭孢唑林、紅霉素、復方新諾明均有一定的耐藥性，可能是頭孢唑林、紅霉素、復方新諾明這3種抗生素較早被廣泛使用的原因；6株乳酸菌對其他抗生素均有不同程度的敏感性；菌株D16耐藥性低于其他菌株，對青霉素、氨芐西林、丁胺卡那、慶大霉素、諾氟沙星和氯霉素6種抗生素均敏感，對頭孢唑林、紅霉素、環丙沙星和復方諾明中度敏感。

表4 乳酸菌藥敏性測定Table 4 Determination of drug sensitivity of lactic acid bacteria

注：R為耐藥，M為中度敏感，S為敏感

2.6 乳酸菌的鑒定

綜合以上實驗結果發現，菌株D16在體外具有較強的降膽固醇及甘油三酯能力，同時其耐酸耐膽鹽能力也在一定程度上強于其他菌株，其對致病菌的抑菌能力較強，且耐藥性較低。因此選擇菌株D16作為輔助降血脂的乳酸菌進行進一步抗氧化性能研究。

以菌株D16基因組DNA為PCR擴增的模板，采用通用的16S rDNA引物進行PCR擴增，得到約1 500 bp的特異性擴增產物。電泳檢測擴增產物后，送至上海生工生物工程有限公司進行測序。通過BLAST比對分析，產物PCR結果見圖1。

1-D16 16S rDNA擴增產物；M-BM2000+DNA Marker圖1 D16 16S rDNA的PCR擴增產物電泳圖Fig.1 The 16S rDNA amplification product of D16

由圖1可知，PCR產物的測序片段長1 500 bp，具有典型的16S rDNA的特征。經GenBank比對分析發現，菌株D16與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)親緣關系最近，同源性達到99%，因此將D16鑒定為植物乳桿菌。

2.7 乳酸菌抗氧化能力的測定

研究發現，氧化應激與肥胖、心血管疾病有著密切的關聯[33-34]。因此，基于前面體外降解膽固醇和甘油三酯實驗的基礎上，對其體外抗氧化能力進行研究，并與市售的4株商業化乳酸菌進行對比。由表5可知，菌株D16與4株商業化乳酸菌均有一定的DPPH自由基清除能力，但D16的無細胞提取液DPPH清除率顯著大于保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌(P<0.05)，達到了37.9%； ABTS自由基清除率同樣顯著大于保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌(P<0.05)，且清除能力差異較大，達到了84.74%；菌株D16與商業化乳酸菌均有一定的鐵還原能力，但其鐵還原能力差異不大，其中菌株D16與保加利亞乳桿菌的鐵還原能力沒有顯著差異(P>0.05)。綜合上述3個抗氧化指標，得出D16的抗氧化能力高于其他4種商業化乳酸菌。吳均[34]從耗牛酸乳中分離得到7株乳酸菌，其無細胞提取液的DPPH自由基清除率最高為29.69%；ABTS自由基清除率最高為35.43%；FRAP值最高為14.68 μmol FeSO4/mL樣品。吳石金等[35]從傳統發酵蔬菜中篩選等到34株乳酸菌中，其無細胞提取物的DPPH自由基清除率最高約為28%。因此D16的抗氧化能力相對較高。

表5 體外抗氧化能力實驗結果Table 5 Antioxidant activity of lactic acid bacteria

3 結論

本研究從云南傳統發酵食品乳餅中分離乳酸菌，經體外降血脂能力初篩，體外胃腸模擬環境耐受性、抑菌及抗藥性復篩，最終篩選得到1株體外降血脂能力及耐酸耐膽鹽能力較強的植物乳桿菌D16，該菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌均有一定的抑制作用，且對多種抗生素藥物具有敏感性；在此基礎上，本研究對該菌株與幾種商業菌株的抗氧化性能進行比較研究，結果發現，植物乳桿菌D16的DPPH自由基清除能力及ABTS自由基清除能力均顯著高于商業化乳酸菌(P<0.05)，鐵還原能力接近于其他菌株。

通過與其他文獻報道和商業菌株的比較，菌株D16的降低膽固醇和甘油三酯能力、環境適應能力和抑制致病菌、敏感性、抗氧化能力較好，具有開發為益生產品的潛能。菌株D16的功能活性是否與云南特殊的高原環境、羊乳原料以及特殊的加工工藝有關，相比市場上眾多的各種成熟商業化菌株，其益生功能和發酵性能如何，由于實驗條件和時間限制，本論文并未進行深入和廣泛的對比評估。另外雖然D16具有較好的體外功能活性，但是其經過胃腸道消化吸收后的體內降血脂、抗氧化等作用能力也尚不可知。因此，本課題組下一步擬對其發酵能力進行評估并對其體內功能活性進行深入研究。

乳酸菌是食品工業中重要微生物資源，在食品、生物、醫藥等領域具有廣闊的應用前景。鑒于我國豐富的發酵食品種類和悠久的歷史，從傳統發酵食品中篩選具有良好降血脂和抗氧化功能的乳酸菌，對豐富我國益生菌種類、挖掘和開發傳統發酵食品資源有重要意義。