常染色體顯性遺傳視網膜色素變性家系的臨床表型和致病突變基因位點鑒定

李菁蒴　湯蘇珍　劉雅寧　陳鵬

[摘要]目的分析一個中國北方視網膜色素變性（RP）家系病人的臨床表型及致病基因突變，尋找致病基因突變位點，探討表型與基因型之間的關系。

方法收集中國北方地區的一個RP家系的臨床資料，共有11例家庭成員參與研究，其中包括5例病人和6例正常成員。完善該家系內所有參與研究成員的眼科檢查，提取該家系中全部成員的外周血基因組DNA，選取先證者進行視覺系統相關目標區域全外顯子組測序，最終通過家系內共分離驗證致病突變，進一步分析該突變與病人表型間的關系。

結果臨床檢查顯示該家系內5例病人均符合典型的RP表型，目標區域外顯子組測序顯示核受體亞科2第E組第3個成員（[STBX]NR2E3）基因c.166G>A突變，該突變導致了[STBX]NR2E3基因所編碼蛋白第56號氨基酸由甘氨酸變為精氨酸（p.56，G>R）;保守性分析顯示該突變在各物種中高度保守，生物信息學預測結果表明該突變具有較高的致病性。

結論該家系內符合典型RP表型病人目標區域外顯子組測序發現了[STBX]NR2E3基因上一個已知的突變（c.166G>A，p.56，G>R），該突變在家系內共分離。

[關鍵詞]視網膜變性;色素細胞;點突變;高通量核苷酸序列分析;[STBX]NR2E3基因

[中圖分類號]R774.13;R394

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2020）01-0030-05

視網膜色素變性（RP）是以早期夜盲，隨后出現漸進性視野缺損、視網膜色素沉著、視盤蠟黃色、視網膜電圖呈熄滅型以及中心視力下降等為主要臨床特征的常見致盲性遺傳眼病[1]。在世界范圍內RP的發病率為1/3800～1/3500，在我國其發病率約為1/3784，全世界至少有100萬病人[2]。此組疾病是導致人類視力障礙最主要的疾病之一。近年來，由于其致盲率有所上升，以及人類基因圖譜的成功建立，RP日益受到眼科學者的關注。已知的RP致病基因或位點多達100個，目前已經克隆50多個基因并闡述了其功能。至2015年，已被定位克隆的常染色體顯性遺傳RP的致病基因有25個[3]。至今已知基因導致常染色體顯性RP（ADRP）約占60%，仍有40%的ADRP病人尚未確定致病基因[4-6]。因此，對ADRP致病基因的定位和克隆仍需進行深入的研究[7]。

本文研究對1個中國北方ADRP家系進行目標區域外顯子測序，以期找到該病的致病基因和突變位點，并探討該病的臨床表型與基因型的關系，旨在為ADRP的病人治療帶來福音。現將結果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集山東省臨沂市1個ADRP家系，該家系共有3代11人，其中RP病人5例，均經詳細全面的眼科檢查如視力、視野、眼底等明確診斷為ADRP。參與本研究的共有11例家系成員，包括5例病人，6例表型正常者。本研究嚴格遵守赫爾辛基宣言，

血液標本的采集和病人的臨床檢查均征得家系成員同意后進行。

1.2方法

1.2.1提取外周血基因組DNA采集所有家系成員的外周靜脈血2～5mL，注入EDTA抗凝管內，置于-80℃冰箱凍存備用;采用全血DNA小量抽提試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）進行外周血DNA提取。

1.2.2目標區域外顯子組測序取該家系中先證者的基因組DNA，應用目標序列捕獲高通量測序技術捕獲人類視覺系統異常相關單基因遺傳病的523個基因的外顯子區域，然后對富集的外顯子文庫進行高通量測序。將突變的基因通過4個正常人的基因數據庫進行過濾：包括單核苷酸多態性（SNP）數據庫（ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/）、千人基因組計劃數據庫（ftp：//ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/）、Hapmap8數據庫（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）及炎黃數據庫（http：//yh.genomics.org.cn/）。

1.2.3PCR擴增和Sanger測序將經過分析篩選得到的獲選變異位點分別利用PCR和Sanger測序驗證。PCR反應條件：94℃、3min;94℃、40s，53℃、40s，72℃、60s，35個循環;72℃10min。然后，應用Sanger測序法分別對每例家系成員的基因組DNA模板與核受體亞科2第E組第3個成員（NR2E3）引物的擴增PCR產物測序。

2結果

2.1臨床特征

該家系為ADRP，共有11例家系成員（圖1），其中包括5例RP病人（Ⅰ1，Ⅱ1，Ⅱ5，Ⅲ1，Ⅲ3）和6例健康成員（Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅱ3，Ⅱ4，Ⅱ6，Ⅲ2）。眼科檢查顯示，5例病人的臨床表型均符合典型的RP的臨床特征。該家系內5例病人的臨床表現較為相似，均自幼夜盲，并在10歲左右出現明顯的視野縮窄及視力下降。先證者Ⅱ1目前雙眼最佳矯正視力均為0.1;其雙眼眼底表現符合典型的RP改變，包括視乳頭色蒼白、視網膜血管迂曲變細、視網膜萎縮及后極部大量骨細胞樣色素沉著等。見表1。

2.2目標區域外顯子組基因測序

針對家系內先證者（Ⅱ1）進行的目標區域捕獲測序所達到的覆蓋率為99.91%，平均測序深度為61.4X。目標區域捕獲測序共捕獲到837個單核苷酸變異（SNVs）和82個插入/缺失變異（Indels）。經過4個SNP數據庫對比過濾，鑒于常染色體顯性遺傳的RP較少見，只保留千人基因組計劃數據庫中等位基因頻率小于0.05的突變，共篩選出8個可能與該家系發病相關的變異，這8個突變分別位于6個基因：NR2E3、BBS4、BBS9、PMM2、PDE6A、CIB2。見表2。

2.3Sanger測序驗證實驗

Sanger測序結果顯示，該家系中5例病人均存在NR2E3基因的第2外顯子的突變，核苷酸改變為c.166G>A，氨基酸改變為p.56，G>R（圖2）;而家系中的6例正常人均不存在該突變。多次測序結果表明，該突變位點并不是因為擴增或測序錯誤引進的。應用點突變預測程序SIFT和PolyPhen的預測結果均顯示，該突變導致了NR2E3蛋白功能“deleterious”級的損壞，從而引起了病人RP的發生。該突變為已知突變，不是新突變。

3討論

RP的遺傳方式較為復雜，目前已知有ADRP、常染色體隱性遺傳RP（ARRP）、X-連鎖遺傳RP（XLRP）[8]、雙基因型遺傳RP（digenicRP）和線粒體遺傳RP（mitochondrialRP）等5種。ADRP占RP的20%～25%，目前共克隆出了25個致病基因，由于ADRP危害較為嚴重，發病率較高，近年來已經成為眼科遺傳學研究的熱點[9]。視紫紅質（RHO）是最早被發現導致RP突變的致病基因[10]。目前已經發現100多種致病突變，90%以上的RHO突變是錯義突變，另外一些是缺失或移碼突變[11]。在北美和歐洲人群中，RHO突變是導致ADRP最常見的原因，占20%～25%。在日本，RHO突變率卻較低，僅為2.5%[12]。

NR2E3基因突變占ADRP致病突變的2%～6%，定位15q23～q25，含有8個外顯子，編碼410種氨基酸的蛋白質[13]。該蛋白質也是配體依賴的轉錄因子，只在成人視網膜外核層表達，在神經細胞的信號轉換、胚胎發育和功能調節方面發揮作用。NR2E3突變的病人的臨床特征是后發性ARRP。最近有研究顯示，NR2E3突變與ADRP有明顯的關系[14]。NR2E3突變的ADRP病人除了具有典型的ADRP臨床表現外，還有眼底高熒光，很少或幾乎沒有視網膜下色素沉著[15]。

NR2E3由5個主要結構域組成，這些結構域在所有核激素受體中都是進化上保守的。N末端的結構域1和2含有高度可變的A/B結構域，其有助于通過激活因子（AF-1）結構域的配體與非依賴性DNA結合;結構域3是核受體最保守的區域，含有DNA結合結構域（DBD）。DNA結合區還含有P-盒以及D-盒，P-盒允許核受體結合獨特的DNA應答元件位點并調節基因表達，D-盒被認為參與蛋白質相互作用。結構域4包含可變鉸鏈區并且通常是核受體中最獨特的序列。結構域5位于C末端部分，包括幾個結構域：LBD、同源和異源二聚化結構域、核定位和配體依賴性激活因子（AF-2）結構域。

配體結合結構域由12個α-螺旋組成，其折疊可以產生配體結合的疏水口袋[16]。通過生物信息學分析發現，DBD位于第39～130位密碼子之間，本實驗結果顯示的突變發生在第56位密碼子，其位點在NR2E3上的位置處于功能結構域內[17]。

p.G56R突變位于NR2E3蛋白的DBD中，而DBD有助于核受體的同聚和異聚。該位點突變會影響

NR3E3同源二聚體的形成。在ADRP病人中，p.G56R突變體蛋白在CRX介導的光感受器特異性基因表達中起抑制作用，這就是其導致RP發生的原因。本文研究中5例病人的臨床表型均符合典型的RP臨床特征，主要包括視乳頭色蒼白、視網膜血管迂曲變細、視網膜萎縮及后極部大量骨細胞樣色素沉著等。目標序列捕獲高通量測序技術是一種新型的基因組分析技術，該技術使用一套核苷酸探針捕獲基因組上的目標序列，然后使用通用引物對這些捕獲到的序列進行擴增，再對這些擴增產物進行高通量生物信息學分析[18]。本研究通過目標區域外顯子組測序及Sanger測序技術并結合生物信息學分析和變異過濾策略，成功地發現了RP致病基因NR2E3（c.166G>A，p.56，G>R）的突變位點。該突變導致了NR2E3基因所編碼蛋白第56位氨基酸由甘氨酸突變為精氨酸（p.L51>P），該突變在RP家系內共分離。

RP危害嚴重且目前尚無有效治愈方法，發現RP可能的致病基因和有害突變，并進行產前預防和基因治療顯得尤為重要[19]。目前已知基因導致的ADRP約占60%，仍有40%的ADRP病人尚未確定其致病基因。因此，對ADRP致病基因的定位和克隆仍需進行深入研究[20]。該病雖然是單基因遺傳病，但遺傳異質性高，有1/3～1/2的病例有遺傳背景[21]。應用傳統的診斷方法很難在分子水平做出正確的診斷。新一代測序技術能夠準確地、全面地發現基因組中的各種DNA異常、遺傳重組突變和其他各種突變等[22]。

自新一代測序技術問世以來，我國在眼遺傳性疾病致病基因的研究中取得前所未有的成果[23-24]。

全外顯子測序是指將基因組中外顯子區域DNA捕獲并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。全部外顯子區及外顯子與內含子的交界區雖然只占全基因的1%，但是大多數與遺傳表型相關的功能性變異位于外顯子區，應用該技術已經找到了很多孟德爾遺傳疾病的致病基因。致病基因的確定不僅有助于早期診斷和早期采取預防措施，還可以診斷不同的致病基因從而采取不同的治療措施，如針對先天性黑矇致病基因RPE65的基因治療可明顯改善臨床病人的病情[25-27]。已有研究在RP、先天性青光眼和先天性白內障等單基因遺傳性疾病中發現新基因或已知基因新突變。還有研究應用全外顯子測序技術發現了RP的致病基因SLC7M4[28]。另外，在近視、原發性青光眼和年齡相關性黃斑變性等復雜性基因遺傳性疾病中亦發現了新的相關性致病基因，如與原發性開角型青光眼相關的基因ABCAI和PMM2[29]。當前遺傳學及基因組學研究上的新突破，使得我們能夠從基因層面認識到遺傳性疾病的成因，從而使遺傳性眼科疾病的基因診斷和治療成為可能[30]。

綜上所述，本文對RP家系進行的基因檢測顯示，NR2E3（c.166G>A，p.56，G>R）基因上的突變位點可能導致了RP的發病。本研究結果不僅豐富了RP致病基因NR2E3的圖譜，而且將為常染色體顯性遺傳性RP的基因治療、產前診斷和預防提供重要的參考。

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（本文編輯 黃建鄉）