核酸適體-膠體金體系檢測氯霉素的研究

鐘惠萍，黃巧娥，王 力

（集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

氯霉素（ChlorChloramphenicol，CAP）能抑制細菌蛋白質的形成，是有效對抗多種革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌和多種厭氧生物的抗生素，因而被廣泛用于人類和其他生物疾病的防治中.但研究表明其存在較嚴重的毒副作用，影響人的身體健康和畜水產品貿易，許多國家已嚴格禁止在食品動物飼養過程中使用，同時實施愈來愈嚴格的監控計劃［1］.但由于其消毒效果良好，價格便宜，導致有些養殖者還在繼續使用，因此，發展快速、靈敏檢測技術、降低檢出限成為氯霉素殘留檢測技術研究焦點［2］.核酸適體［3］是一種新型仿生生物識別元素，具有和抗體相媲美的親和力和選擇性，在食品安全領域，多種抗生素物質的核酸適體已被成功篩選和應用［4］.本研究利用可以特異性識別氯霉素分子的核酸適體作為識別元素，結合膠體金［5］團聚后吸光性質變化的現象對氯霉素進行檢測.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

氯霉素、氯霉素核酸適體、檸檬酸鈉、氯金酸、氯化鈉、Tris.

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體金溶液的制備

將100 mL 0.4 g·L-1氯金酸溶液倒入圓底燒瓶中，用封口膜及橡膠圈將瓶口封住，水浴加熱至沸騰，劇烈攪拌下快速加入10 mL10 g·L-1的檸檬酸三鈉溶液.待溶液顏色由深紫色變成酒紅色，繼續攪拌10 min.將制備好的膠體金溶液冷卻至室溫，裝于瓶中，用錫箔紙包裹，置于4 ℃冰箱中冷藏備用［6］.

1.2.2核酸適體溶液的配制

本實驗所用氯霉素核酸適體堿基序列為：ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G［7］.配制方法如下：取裝有40 nmol氯霉素核酸適體的管子，開蓋前先在4000 rmp離心5min，慢慢打開管蓋，加入100 μL 的純化水，使其濃度為400 μmol·L-1，蓋上蓋后渦旋使之充分混勻，放入-20 ℃儲藏備用.

1.2.3 核酸適體包被膠體金制備

取1 mL上述合成的膠體金與1 μL氯霉素核酸適體溶液，室溫下置于震蕩器中混合1 h，在4 000 rmp離心20 min，取下層沉淀物分散于2 mL pH=7.4 的Tris-HCl 緩沖液中，得到氯霉素核酸適體包被的膠體金［8］.

1.2.4 氯霉素的檢測

取上述氯霉素核酸適體包被的膠體金溶液2 mL，加入250 μL一定濃度的氯霉素溶液，混合均勻后在震蕩器中反應15 min.然后慢慢加入250 μL 1 mol·L-1的氯化鈉溶液，置于震蕩器中混合15 min，用酶標儀掃描溶液在350-750 nm范圍內的吸收光譜，比較520 nm以及620 nm處的吸光度變化值.

2 結果與討論

2.1 膠體金-核酸適體體系檢測氯霉素的有效性

圖1是不同體系下膠體金紫外可見光譜圖，從圖中可以看出，在膠體金溶液中加入氯化鈉時，膠體金團聚，520 nm 處吸光度降低，620 nm 處有新的吸收峰；當先加入核酸適體再加氯化鈉時，620 nm 無吸收峰，與膠體金本身吸收曲線基本相同，說明適體包被膠體金后對膠體金起穩定分散作用［9］，使得膠體金在一定濃度氯化鈉下不發生團聚；而當在上述體系中加入氯霉素時，620 nm處吸收峰明顯加強，說明適體與氯霉素分子結合，膠體金失去保護，發生團聚.實驗結果表明，核酸適體包被的膠體金檢測方法可以用于氯霉素的檢測中.

2.2 氯霉素檢測標準曲線及靈敏度

在氯霉素核酸適體包被的膠體金溶液中加入不同濃度的氯霉素溶液，圖2（a）顯示，隨著氯霉素濃度的增加，溶液在520 nm處的吸收峰強度逐漸降低，而620 nm處的吸收峰強度逐漸升高；圖2（b）顯示，在氯霉素濃度為10～50 μmol·L-1范圍內，膠體金A620nm/A520nm比值與氯霉素的濃度呈現良好的線性關系，線性方程為：y=0.003x+0.279，相關系數R2=0.9904，檢出限為3.76 μmol·L-1（3 σ/k，n=9）.

2.3 檢測體系的選擇性

為了考察檢測體系的選擇性，選取了五種氯霉素結構類似物及相關獸藥進行了實驗，分別是：呋喃西林（NF）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四環素（TC）.將每種樣品配制成50 μmol·L-1的溶液，按氯霉素（CAP）的檢測條件進行測定，在350-750 nm范圍內掃描紫外可見吸收光譜，計算A620nm/A520nm.每種樣品平行測定三次，表1結果分析顯示樣品測定值重復性較好，標準偏差均遠小于平均值的10%.根據圖3 可知，加入氯霉素結構類似物的吸光度比值A620nm/A520nm與空白值很接近，差值在0.03以內；而加入氯霉素的A620nm/A520nm值與空白值差值達到0.16.實驗結果說明，這些結構類似物與氯霉素核酸適體的親和力比較低，響應較小，氯霉素核酸適體可以選擇性結合氯霉素分子，因此氯霉素核酸適體包被的膠體金檢測方法可以用于氯霉素的特異性檢測中.

表1 氯霉素及其結構類似物吸光度比值A620 nm/A520 nmTab.1 Absorbance ratio A620 nm/A520nm of CAP and its analogues

3 結論

基于氯霉素核酸適體和膠體金建立了一種檢測氯霉素的方法，方法具有高靈敏度和高選擇性.該法簡便易行，滿足樣品現場、快速的檢測需求.