菠蘿液泡膜水通道蛋白基因AcTIP1-1的克隆、重組載體構(gòu)建

董 樂，李小琴，王 芳，陳明賢，麻彤輝，陳洪彬，邱呂萍，陳月釵

（1.泉州師范學院 海洋與食品學院，福建 泉州 362000；2.泉州市農(nóng)業(yè)科學研究所，福建 晉江 362212）

水孔蛋白（aquaporins，AQPs）即水通道蛋白（water channel proteins），是一組轉(zhuǎn)運蛋白，為水分跨細胞膜的運輸提供選擇性的通道，由美國科學家Peter Agre 在1988 年所發(fā)現(xiàn)［1］.AQPs 屬于古老的內(nèi)在蛋白（major intrinsic proteins，MIPs）家族成員.Johanson等［2］根據(jù)其亞細胞定位及氨基酸序列同源性合，將其分為5 種類型：液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma intrinsic proteins，PIPs）、小的堿性內(nèi)在蛋白（small basic intrinsic proteins，SIPs）、NOD26-like 內(nèi)在蛋白（NOD26-like intrinsic proteins，NIPs）和類GlpF膜內(nèi)在蛋白（GlpF-like intrinsic proteins，GIPs）.

迄今為止，已在擬南芥、水稻、玉米、煙草、豌豆等多種植物中發(fā)現(xiàn)AQPs基因，并將其成功克隆［3-5］.已經(jīng)測序的植物基因組揭示植物AQPs是一個超家族：擬南芥中有38 個AQPs基因編碼的35 種AQPs同源蛋白，其中13個屬于PIPs及其類似蛋白，10個屬于TIPs及其類似蛋白，12個屬于NML類；在水稻和玉米中，分別有33個和35個AQPs［6］.AQPs存在于參與水分、離子集流的細胞中，這些細胞一般是正在分裂和伸長的細胞及幼嫩部位，如表皮細胞、正在發(fā)育的根和芽、雄穗等［7］.研究表明，AQPs不僅可選擇性轉(zhuǎn)運水分，還可轉(zhuǎn)運甘油、尿素、氨氣、過氧化氫、亞銻酸鹽、醇類小分子、重金屬和乳酸等溶質(zhì)［8］.

AQPs參與了植物很多重要的生理過程，如除水以外的物質(zhì)運輸、細胞的滲透調(diào)節(jié)、細胞的伸長和分化、植物的氣孔運動等［8-13］，在響應逆境脅迫中部分AQPs也起著至關(guān)重要的作用［14］.AQPs的表達量在植物受到低溫、高溫和干旱等環(huán)境因素脅迫時會發(fā)生顯著的變化［15］.一些AQPs的表達受光質(zhì)的誘導，受晝夜節(jié)律基因的調(diào)控，并參與植物的抗旱應答反應［16］.

菠蘿（Ananas comosus（L.）Merrill）原名鳳梨，屬鳳梨科鳳梨屬，為景天酸代謝（crassulacean acid metabolism，CAM）植物.菠蘿原產(chǎn)美洲，在我國主要分布在福建、云南、海南、廣西、廣東等省［17］.菠蘿適應逆境脅迫環(huán)境，在光合作用及耐旱性方面形成了更為進化的生理與遺傳特征.2015年，明瑞光等［18］首次破譯了菠蘿基因組，通過對基因組進行分析發(fā)現(xiàn)了菠蘿中景天酸代謝光合作用的調(diào)控元件，同時分析出該元件受晝夜節(jié)律基因的調(diào)控，從而發(fā)現(xiàn)了菠蘿的“光合開關(guān)”.

為了探討AQPs是否參與菠蘿“光合開關(guān)”，首先要分離和鑒定AQPs基因，并分析其表達模式和通透性.本研究以菠蘿果實為材料，擴增GenBank中登錄號為XM_020238793.1的菠蘿TIPs（AcTIP1-1）的開放閱讀框（open reading frame，ORF）和編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列，并將其分別亞克隆到原核表達載體pET32a（+）及載體pSP64 Poly（A）上，構(gòu)建成重組載體.重組載體pET32a（+）-AcTIP1-1的成功構(gòu)建可為誘導表達并純化融合蛋白制備抗體，為研究AcTIP1-1的組織分布和時空表達奠定基礎(chǔ)；重組載體pSP64 Poly（A）-AcTIP1-1的成功構(gòu)建可為制備含有Poly（A）+的AcTIP1-1轉(zhuǎn)錄子從而開展AcTIP1-1的通透功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗植物 菠蘿由福建省泉州市農(nóng)科所提供.

1.1.2 試劑盒及其他常規(guī)試劑TRIzol?Reagent（Invitrogen，美國）、Oligotex?≥mRNA Mini Kit（Qiagen，美國）、Reverse Transcription System（Promega，北京）、Taq DNA 聚合酶（Invitrogen，美國）、QIAquick? PCR Purification Kit（Qiagen，美國）、QIAquick?Gel Extraction Kit（Qiagen，美國）、pCR?2.1 vector（Invitrogen，美國）、pET32a（+）（Invitrogen，美國）、pSP64 Poly（A）（Invitrogen，美國）、QIAprep?Spin Miniprep Kit（Qiagen，美國）、EcoR I（Neb，美國）、Hind III（Neb，美國）、XhoI（Neb，美國）、XbaI（Neb，美國）、T4DNA連接酶（Neb，美國）、DNA分子量標準（Neb，美國）、瓊脂糖（UltraPure，上海）、大腸桿菌（E.coli）感受態(tài)菌株DH5α（天根生化科技有限公司，北京）、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl βd-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（Promega，北京），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-d-galactopyranoside，X-Gal）、三羥甲基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）均購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司，其它試劑皆為國產(chǎn)分析純.

1.1.3 引物設計 根據(jù)GenBank中登錄的蓖麻AcTIP1-1（登錄號：XM_002522148.3）的全長cDNA序列分別設計擴增AcTIP1-1的ORF 和CDS 序列的特異性引物.擴增AcTIP1-1ORF 序列所用的引物為P1 和P2，擴 增AcTIP1-1CDS 序 列 所 用 的 引 物 為P1 和P3. 引 物 序 列 如 下，P1：CCCAAGCTT（Hind III）ATGCCGATCTCTCGGATCGC；P2：CCGCTCGAG（XhoI）GTAGTCGGGCGGGGGGATC；P3：GCTCTAGA（XbaI）GTAGTCGGGCGGGGGGATC.引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理 選取正常的土壤管理、水肥管理、整形修剪和病蟲害防治的菠蘿植株上的健康、無病蟲害的果實，用滅菌的剪刀在果實組織部位剪下組織塊，用于提取總RNA.

1.2.2 總RNA 的提取 取上述1.2.1 中采集的蓖麻果實加液氮研磨后，按試劑盒操作說明書進行.總RNA的質(zhì)量和濃度分別用1.5%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測.

1.2.3 mRNA的純化 按試劑盒操作說明書進行.

1.2.4 cDNA第一鏈的合成 按試劑盒操作說明書進行.

1.2.5AcTIP1-1ORF序列的擴增 以cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR，PCR反應體系和反應條件分別見表1和表2.

表1 PCR反應體系Tab.1 PCR reaction system

表2 PCR反應條件Tab.2 PCR reaction condition

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段回收，回收產(chǎn)物與載體pCR?2.1連接.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli菌株DH5α進行培養(yǎng)，挑選白色單克隆菌落分別培養(yǎng)后提質(zhì)粒［19］.經(jīng)EcoR I酶切鑒定篩選陽性重組載體.測定經(jīng)酶切鑒定的陽性重組載體pCR?2.1-AcTIP1-1的基因序列.

1.2.6 重組表達載體pET32a(+)-AcTIP1-1的構(gòu)建 以經(jīng)測序鑒定序列正確的重組載體pCR?2.1-AcTIP1-1為模板進行PCR，與表1 中PCR 反應體系比較，變化在于模板由4 μL cDNA 變?yōu)?.5 μL pCR?2.1-AcTIP1-1.將PCR產(chǎn)物和載體pET32a（+）分別用Hind III和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物構(gòu)建載體制備質(zhì)粒按文獻［20］進行.陽性重組載體pET32a（+）-AcTIP1-1的鑒定篩選用Hind III和XhoI雙酶切.測定經(jīng)酶切鑒定的陽性重組載體pET32a（+）-AcTIP1-1的基因序列.

1.2.7 重組載體pSP64 Poly(A)-AcTIP1-1的構(gòu)建 以經(jīng)測序鑒定序列正確的重組載體pCR?2.1-AcTIP1-1為模板進行PCR，與表1 中PCR 反應體系比較，變化在于模板由4 μL cDNA 變?yōu)?.5 μL pCR?2.1-AcTIP1-1.將PCR產(chǎn)物和載體pSP64 Poly（A）分別用Hind III和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物按1.2.6 步驟制備質(zhì)粒.陽性重組載體pSP64 Poly（A）-AcTIP1-1的鑒定篩選用Hind III和XbaI雙酶切.測定經(jīng)酶切鑒定的陽性重組載體pSP64 Poly（A）-AcTIP1-1的基因序列.

1.2.8 基因序列測定與分析 序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.用DNA MAN 對AcTIP1-1ORF序列、氨基酸編碼序列進行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿果實總RNA的提取

菠蘿果實的總RNA 在變性瓊脂糖凝膠上電泳后的結(jié)果如圖1.由圖可見，28S rRNA和18S rRNA條帶具特異性.因此，所提取的總RNA質(zhì)量較好，可以用來進行后續(xù)實驗.

2.2 AcTIP1-1 ORF的克隆

以菠蘿果實總RNA 中純化的mRNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.以cDNA 為模板進行RT-PCR 擴增AcTIP1-1ORF序列.PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2.由圖可見，在分子量大小約771 bp左右的位置存在一條清晰的條帶，該條帶與預期AcTIP1-1ORF 序列長度753 bp 加酶切位點序列長度之和18 bp相近.

凝膠上的特異性條帶切膠回收后，與載體pCR?2.1連接后轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，挑選白色單克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒.質(zhì)粒用EcoRI酶切的產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖3.由圖可見，泳道上在分子量大小為3900 bp和787 bp左右處有特異性條帶，條帶的大小分別與載體pCR?2.1、AcTIP1-1ORF序列長度753 bp加上酶切位點序列長度16 bp之和的大小一致，因此，該質(zhì)粒為陽性重組載體pCR?2.1-AcTIP1-1.

2.3 克隆片段的測序及序列分析

將篩選出的陽性質(zhì)粒測序后，用DNA MAN 對其進行序列分析，結(jié)果表明，獲得的cDNA 序列與GenBank中公布的AcTIP1-1ORF序列一致，序列長度為753 bp，堿基序列和推斷的氨基酸序列見圖4.

2.4 重組表達載體pET32a(+)-AcTIP1-1的構(gòu)建

以測序的重組載體pCR?2.1-AcTIP1-1為模板進行PCR，將擴增的產(chǎn)物和原核表達載體pET32a（+）分別用HindIII和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖5.由圖可見，產(chǎn)物的條帶具特異性.

將載體與目的基因片段的特異性條帶切膠回收后，回收產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落培養(yǎng)后提質(zhì)粒.質(zhì)粒用Hind III和XhoI雙酶切產(chǎn)物的電泳圖譜見圖6.由圖可見，酶切質(zhì)粒泳道上在分子量大小為5900 bp和759 bp左右處有特異性條帶，其大小分別與載體pET32a（+）、AcTIP1-1ORF序列長度753 bp加上酶切位點序列長度6 bp之和的大小一致，因此，該酶切質(zhì)粒為陽性重組載體質(zhì)粒.

將篩選出的陽性重組載體測序，序列分析結(jié)果表明，未產(chǎn)生移碼突變，與pCR?2.1-AcTIP1-1的序列完全一致，即原核表達重組載體pET32a（+）-AcTIP1-1構(gòu)建成功.

2.5 重組載體pSP64 Ploy(A)-AcTIP1-1的構(gòu)建

以上述測序的原核表達重組載體pCR2.1-AcTIP1-1質(zhì)粒為模板進行PCR，PCR產(chǎn)物的電泳圖譜見圖7.由圖可見，PCR產(chǎn)物條帶清晰，特異性強，與預期大小一致.

將凝膠上的特異性條帶切膠回收后，回收產(chǎn)物和載體pSP64 Ploy（A）分別用HindIII和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落培養(yǎng)后提質(zhì)粒.質(zhì)粒用HindIII和XbaI雙酶切產(chǎn)物的電泳圖譜見圖8.由圖可見，酶切質(zhì)粒泳道上在分子量大小為3030 bp和756 bp左右處有特異性條帶，其大小分別與載體pSP64 Ploy（A）、AcTIP1-1ORF 序列長度750 bp 加上酶切位點序列長度6 bp 之和的大小一致，因此，該酶切質(zhì)粒為陽性重組載體質(zhì)粒.

將篩選出的陽性重組載體質(zhì)粒測序，序列分析結(jié)果表明，未產(chǎn)生移碼突變，與pCR2.1-AcTIP1-1的序列完全一致，即重組載體pSP64 Ploy（A）-AcTIP1-1構(gòu)建成功.

3 討論與結(jié)論

植物AQPs 中有些是組成型表達的，而大多數(shù)是受環(huán)境因子如干旱、鹽害、激素和光質(zhì)等誘導表達的，即植物AQPs的表達是受調(diào)控的，調(diào)控機制可以分為轉(zhuǎn)錄后水平、轉(zhuǎn)錄水平和膜運輸水平3類［21］.植物AQPs 表達調(diào)控經(jīng)常從mRNA 和蛋白質(zhì)水平兩個方面進行分析［22］.蛋白質(zhì)水平分析的常規(guī)技術(shù)——Western blot需要針對所研究蛋白的相應抗體，而抗體制備的前提是獲得該蛋白.原核表達系統(tǒng)遺傳背景清楚，培養(yǎng)方法比較簡單、經(jīng)濟，蛋白表達量高，易于大規(guī)模工藝化生產(chǎn)，且技術(shù)已相當成熟，因此成為目前應用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)之一［23］.pET32a（+）載體中存在6個組氨酸標簽，利用Ni2+親和層析柱具有吸附6個組氨酸標簽的高度特異性，通過一步親和層析也可達到較高的純度［23］.本研究擴增獲得菠蘿液泡膜水通道蛋白基因AcTIP1-1（GenBank登錄號：XM_020238793.1）的ORF序列，并成功構(gòu)建重組載體pET32a（+）-AcTIP1-1，這為誘導表達并純化融合蛋白制備抗體，以研究AcTIP1-1的組織分布和時空表達奠定基礎(chǔ).

植物AQPs可選擇性轉(zhuǎn)運多種中性小分子，AQPs 的功能檢測目前最常用的是非洲爪蟾卵母細胞［24］.該系統(tǒng)是體外制備含有Poly（A）+的AQPs 基因的轉(zhuǎn)錄子，將轉(zhuǎn)錄子注射入爪蟾卵母細胞進行表達后測定其功能.本研究擴增AcTIP1-1的CDS 序列，并成功構(gòu)建重組載體pSP64 Poly（A）-AcTIP1-1，這為制備含有Poly（A）+的AcTIP1-1轉(zhuǎn)錄子從而開展AcTIP1-1的通透功能研究奠定基礎(chǔ).