蒙成藥扎沖十三味丸對大鼠心臟的亞急性毒理學研究

強 欣，塔娜，韓 雪，張 娟，孫曉宇，張小芬，陶 春，奧·烏力吉

（1.內(nèi)蒙古民族大學 醫(yī)學院病理學教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.赤峰市醫(yī)院司法鑒定所，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蒙成藥扎沖十三味丸早已被《藥典》收錄，是蒙醫(yī)臨床傳統(tǒng)名貴藥方之一.出自《至高要方》，由訶子、草烏（制）、禹糧土、麝香、珊瑚（制）、珍珠（制）、木香、石菖蒲、沉香、甘草、丁香、磁石（制）、肉豆蔻13種成份組方配伍而成［1］.臨床治療使用療程長、范圍廣.檢索國內(nèi)外主流數(shù)據(jù)庫至今未發(fā)現(xiàn)關(guān)于心臟毒理學研究方面的文獻報道.本研究通過觀察大鼠在用藥后的一般情況、心率、心電圖、生化指標、形態(tài)學及臟器系數(shù)方面的變化，探討不同劑量時蒙成藥扎沖十三味丸對心臟亞急性毒性作用，從而指導臨床安全用藥.

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、主要試劑和儀器

健康成年清潔級（Sprague-Dawley，SD）大鼠80只，雄性，體重（200±20）g.由《遼寧長生生物技術(shù)有限公司》提供，許可證號為《SCXK（遼）2015-0001》.蒙成藥扎沖十三味丸由內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司生產(chǎn)，生藥扎沖十三味由內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院生產(chǎn)，其余試劑均購買于索萊寶生物科技有限公司.CPA225D 型電子天平購置賽多利斯科學儀器有限公司，BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)購置成都泰盟科技有限公司，MR-96A 型酶標儀和MW-12A 型洗板機購置深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，其余設(shè)備均來自德國徠卡公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及記錄資料

取80只SD大鼠分為正常對照組、蒙成藥扎沖十三味丸中劑量組、蒙成藥扎沖十三味丸高劑量組、生藥扎沖十三味組等4組.實驗前禁食12 h，后在恒溫清潔房間內(nèi)飼養(yǎng)2周，每天記錄大鼠的基本情況.1.2.2 動物稱重、給藥劑量、藥物配制方法、給藥方法、喂養(yǎng)、觀察及處死1.2.2.1 稱重及計算動物給藥劑量 將每只SD 大鼠使用電子天平進行體重測量，根據(jù)人民衛(wèi)生出版社《藥理實驗方法學》［2］得出大鼠用藥量約是成人用藥量的6倍，但是前期預實驗證實低劑量組無統(tǒng)計學意義，故本研究沒有設(shè)計低劑量組.即：中劑量組用藥量為0.432 g·kg-1，高劑量組（最大耐受量）為

10.80 g·kg-1，生藥組劑量同于高劑量組，為10.80 g·kg-1.

1.2.2.2 藥物配制方法 蒙成藥扎沖十三味丸以蒸餾水配制研磨、溶解.生藥組按照蒙成藥扎沖十三味丸的組方稱取生藥1080 g，磨碎、混勻，用1000 mL蒸餾水溶解（劑量約1.08 g/mL），放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2.3 給藥方法 按大鼠體重計算藥量，使用專業(yè)灌胃針每日定時對大鼠進行藥物灌注一次，連續(xù)給藥21天.將正常對照組以等同劑量蒸餾水進行灌胃.

1.2.2.4 喂養(yǎng)及觀察 將SD大鼠在恒溫清潔狀態(tài)下進行飼養(yǎng)，每天定時喂食并觀察一般情況、中毒反應及死亡情況.

1.2.2.5 處死 在第22天采取腹主動脈取血的方法將其處死.

1.3 心率和心電圖的檢測

灌胃給藥后第21天采用10%的水合氯醛麻醉后，在大鼠的四肢分別插入一根注射針頭，然后將導線與大鼠四肢連接后使用BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)引導出導聯(lián)心電圖，觀察大鼠心率和心電圖的變化.

1.4 血清LDH、AST和α-HBDH的檢測

提取血液離心后，取血清，采用Mindray MR-96A 酶標儀進行雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測.嚴格按照試劑及儀器設(shè)備說明書進行操作.在EXCEL工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應吸光度（OD）值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，并按曲線方程計算各樣本濃度值.

1.5 組織病理學觀察

心臟離體后迅速放入4%多聚甲醛固定液中進行固定，后常規(guī)制片、HE染色.光學顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)的變化.

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學檢驗.對經(jīng)正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)使用xˉ±s進行描述；各組樣本均數(shù)進行t檢驗.P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表示存在顯著差異.

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各組大鼠在用藥21天內(nèi)出現(xiàn)不同的反應.見表1.

表1 各組大鼠一般情況Tab.1 General condition of rats in each group

2.2 心率及心電圖

正常對照組及中劑量組大鼠心律齊，呈竇性心律，心率在每分鐘320～500次之間，但中劑量組偶有ST段改變；高劑量組和生藥組大鼠與正常對照組相比較，心率降低（P＜0.01），見表2，高劑量組大鼠心率在每分鐘150～440次之間，心律不齊，心電圖顯示QRS波形提前出現(xiàn)，寬大畸形.生藥組大鼠心律不齊，每分鐘75～390次，心電圖顯示P波消失，QRS波形寬大畸形，五個以上室性期前收縮連續(xù)出現(xiàn).

表2 各組大鼠的心率及LDH、AST、α-HBDH在各組的水平（xˉ±s）Tab.2 Heart rate and LDH，AST and α-HBDH levels in each group of rats（xˉ±s）

2.3 生化指標結(jié)果

2.3.1 血清乳酸脫氫酶（LDH）水平 與正常對照組血清LDH水平比較：中劑量組水平略有降低，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高劑量組及生藥組水平均升高，均存在顯著性差異（P＜0.01）.見表2.

2.3.2 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平 與正常對照組血清AST水平比較：中劑量組水平略有升高，但二者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）；高劑量組及生藥組水平均升高，具有顯著性差異（P＜0.01）.見表2.

2.3.3 血清α-羥丁酸脫氫酶（α-HBDH）水平 與正常對照組血清α-HBDH水平比較：中劑量組、高劑量組及生藥組水平均有所降低，且均存在顯著性差異（P＜0.05）.見表2.

2.4 臟器系數(shù)

與正常對照組臟器系數(shù)相比較：中劑量組無顯著性差異（P＞0.05）；高劑量組大鼠的心臟、肝臟和腎臟的臟器系數(shù)水平升高，均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；生藥組大鼠的心臟、肝臟及腎臟的臟器系數(shù)均有不同程度的升高，均具有顯著性差異（P＜0.01）.見表3.

表3 各組大鼠的臟器系數(shù)（xˉ±s）Tab.3 Organ coefficient of each group of rats（xˉ±s）

2.5 形態(tài)學觀察

正常對照組及中劑量組心臟在細胞形態(tài)方面未見異常（圖1，圖2）.高劑量組部分橫斷心肌細胞質(zhì)內(nèi)可見粉染顆粒樣物質(zhì)，甚至形成空泡（圖3）.生藥組大部分心肌細胞腫脹，染色明顯變淺，形成空泡狀，甚至個別心肌細胞肌纖維溶解（圖4）.

3 討論

扎沖十三味丸中劑量組大鼠在用藥21天后未出現(xiàn)中毒反應，心率、心電圖正常，生化指標及細胞形態(tài)未見異常，說明中劑量安全可靠.高劑量組和生藥組在用藥21天后均出現(xiàn)一般中毒反應，且均出現(xiàn)心率降低、心律不齊和室性期前收縮等表現(xiàn).有學者認為可能是由于制草烏炮制不當造成［3-4］，制草烏內(nèi)含有劇毒成分烏頭堿.有研究表明［5-6］，烏頭堿中毒后由于副交感神經(jīng)興奮，可導致流涎增多；亦可出現(xiàn)唇舌及四肢發(fā)麻、言語困難、心律不齊等癥狀；心電圖顯示頻發(fā)多源性期前收縮，室性心動過速及房室傳導阻滯等變化.研究提示［7］，烏頭堿對心臟的毒性作用機制可能是由于其直接作用于心臟后使心肌細胞膜上的Na+-K+ATP活性降低，Na+通道開放，Na+向內(nèi)流動速度增加，使細胞內(nèi)Na+濃度增加，K+濃度降低，促進細胞膜去極化，產(chǎn)生高頻異位節(jié)律［8-9］.高劑量組和生藥組大鼠的中毒反應、心率和心電圖的改變符合烏頭堿中毒的表現(xiàn).

研究表明［10］，當病毒和細菌感染、中毒及腫瘤等造成心肌損害時，心肌細胞膜的通透性增強，LDH、AST易漏出到細胞外致使其水平升高.本研究中生藥組和高劑量組檢驗結(jié)果均發(fā)現(xiàn)血清LDH、AST濃度水平升高，中劑量組血清LDH 水平未見明顯改變.王永田等［11-12］發(fā)現(xiàn)藥物中毒后，LDH、α-HBDH、CK、CKMB 及AST 的檢測可以作為確診心肌損傷的重要方法.本研究中劑量組、高劑量組及生藥組血清α-HBDH水平均不同程度降低，理論上講，細胞損傷后，酶原大量釋放，α-HBDH水平應該上升，本研究中各組血清α-HBDH水平均降低，這與Preus M［13］的研究結(jié)果相一致，α-HBDH降低機制尚不清楚，需要進一步研究探討.

臟器系數(shù)是動物實驗中重要的觀察指標，其變化可反映毒物對該臟器的毒性綜合作用，從而幫助對內(nèi)臟器官的功能狀態(tài)和病變的性質(zhì)等進行判斷.臟器系數(shù)升高常表明臟器發(fā)生增生、水腫等病理改變，其降低常提示臟器萎縮或退行性等病理改變［14］.生藥組和高劑量組大鼠心臟的臟器系數(shù)均增大，組織學觀察主要因為心肌細胞發(fā)生了水腫等改變引起.目前，扎沖十三味丸中毒對心臟損害的機制尚不明確，有學者認為，當心臟缺血或缺氧時，心肌細胞內(nèi)缺氧、代謝產(chǎn)物的蓄積和跨膜蛋白功能的喪失可導致心肌水腫等損傷.

通過心率、心電圖、生化指標及形態(tài)學觀察等指標結(jié)果顯示，其中生藥組的毒性要重于蒙成藥；故認為制草烏等炮制不規(guī)范導致生藥組中烏頭堿含量過高，所以在一定程度上可能與心肌組織中烏頭堿含量有關(guān).