辣木葉粉酵母發酵破壁提取和純化工藝研究

呂禹澤，丁小梅，王 力，賴海濤

（集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

辣木又名鼓槌樹［1］，是一種辣木科的速生多功能植物，廣泛種植在包括泰國在內的亞熱帶和熱帶地區［2］，在食品和醫療領域中應用研究日益深入、成熟.其種子、樹葉、樹皮、根和花均含有豐富的營養物質［3］，包括蛋白質、必需氨基酸、維生素（維生素A、B、C和E）、礦物質（鐵、鈣和鉀等）和其他營養素（γ-氨基丁酸和β-胡蘿卜素等）［4-7］，擁有“生命之種”和“奇跡之樹”的美名［8-9］.同時，辣木不僅可以食用，還具有重要醫用價值［1］.其中辣木的根在反復性發熱的治療方面具有奇效［10］；辣木的種子含有豐富的油脂類（19%～47%），蛋白質（10%～52%）和芥子油苷（2.5%～20%）等，其種子油中富含不飽和脂肪酸（如油酸等），如今已被用作優質植物油和傳統藥物，用于治療關節炎、風濕病和高血壓［11］；辣木的花對肌腱發炎或者膿腫有消炎作用［12］；辣木的樹皮可幫助消化，治愈皮膚的感染及潰瘍癥狀［13］；研究發現，辣木葉可用于治療多種疾病，在傷寒、哮喘、咳嗽、寄生蟲病、關節炎、糖尿病、割傷、皮膚紅腫和皮膚疾病、泌尿生殖系統疾病、高血壓、身體疼痛和無力等的治療中具有重要作用［14］.

多酚類物質是辣木中重要的功能性成分之一，植株的多酚提取物的抗氧化性很強［15］.Vongsak等［16］人在選擇傳統的提取措施提取辣木多酚物質時，發現采用浸提的方法，以70%的乙醇溶液為提取劑能夠取得最大的提取率，且所得的辣木提取液具有較好的抗氧化活性.為了提高多酚類物質的提取率，人們提出了許多方法，目前提取效果較為可觀的方法有微波［17-18］、亞臨界萃取［19］和超聲波［20-21］等.這些方法其實都是通過破壞辣木組織細胞中的細胞壁，再通過一些溶劑將細胞中的物質溶解并提取出來，經過進一步的分離純化獲得高純度的所需物質.故如何能使得植物的細胞壁破碎，對于提高對多酚的提取率具有重要意義.本文采用干性酵母-發酵方法對辣木葉粉進行破壁研究并以期得到最佳破壁條件及純化工藝，為工廠規范化生產提供技術參數，為辣木葉粉作為天然飲料、保健品及化妝品等的研發提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器 辣木葉粉：辣木葉由廈門天竺辣木種植基地提供，辣木葉經實驗室處理后制得辣木葉干粉.高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；鹽酸、福林酚試劑、磷酸氫二鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司，大孔樹脂Sephadex LH-20：滄州寶恩吸附材料科技有限公司.

CP214型電子天平：美國OHAUS儀器（上海）有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；RV8型旋轉蒸發儀：廈門精藝興業科技有限公司；ZX-15-07型冷凍干燥機：賽默飛世爾科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉預處理 首先對實驗室所購辣木葉進行篩選，選用新鮮的辣木葉，去除枯葉爛葉.將篩選的辣木葉在80 ℃下進行烘干處理.再放入攪拌機進行多次粉碎處理，直至辣木葉成相對均勻的粉狀物.經上述步驟所得粉狀物再過80目篩，最終獲得實驗所需的辣木葉粉，該辣木葉粉需在低溫、避光、干燥的環境條件下保存.

1.2.2 總酚含量的測定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法［22］，使用超純水進行配制濃度為50 μg·mL-1的沒食子酸標準液.室溫下依次量取0～0.45 mL（0.05 mL的梯度間隔）濃度梯度的配制好的液體至10 mL比色管中.每個比色管分別加入超純水定容至1 mL，再往比色管中加入1.5 mL福林酚溶液（由福林酚試劑與水比例1∶1配制而成）.將比色管內的液體充分搖晃混勻后放置在室溫中反應3 min.反應結束之后分別往每個比色管中加入3 mL碳酸鈉溶液（質量分數為12%），充分搖晃混勻后將比色管放置在暗處反應2 h.最后測每個比色管的A762值，測得數據用Origin作圖［23］.

2 結果與分析

2.1 沒食子酸的標準曲線 在電腦制圖軟件Origin中，以在762 nm下測得的吸光值A762為Y軸，不同濃度的沒食子酸為X軸，完成標準曲線的繪制.由所得標準曲線（圖1）可知：沒食子酸在濃度0～50μg·mL-1與A762有著非常好的線性關系.本實驗的標準曲線線性回歸方程y＝0.0927x+0.00122，其相關系數為R2=0.9992.按照沒食子酸的標準曲線線性回歸方程可以計算得出在波長762 nm下，已知吸光度所對應的提取液中多酚的含量.

2.2 酵母發酵法條件的優化

2.2.1 干性酵母添加量 稱取干燥的辣木葉粉10.0 g，加水20 mL 使辣木葉粉潤濕溶解，改變酵母添加量，于32 ℃的培養箱內培養3 d，再置于37 ℃的水浴酶解6 h，見圖1.從圖1可知，干性酵母添加量對破壁后總黃酮含量的影響較為明顯.隨著酵母添加量的增大，破壁后的樣品溶液中吸光度先逐漸增大，當酵母添加量為0.3%時，吸光度最大，即破壁后的樣品溶液中總黃酮的含量達到最高，當酵母添加量大于0.3%時，破壁后的樣品溶液中吸光度呈現減小趨勢，即破壁后的樣品溶液中總黃酮逐漸降低.故干性酵母添加量選取0.3%.

2.2.2 加水量 稱取干燥辣木葉粉10.0 g，干性酵母添加量為0.3%，改變加入的辣木葉粉中加水量，其他條件同2.1.1，結果見圖3.由圖3可知，加水量對破壁后總黃酮含量的影響較大.隨著加水量的增大，破壁后的樣品溶液中吸光度先逐漸增大，當加水量為辣木葉粉量的4倍（40 mL）時，破壁后的樣品溶液的吸光度達到最大，當加水量大于40 mL時，破壁后的樣品溶液中吸光度呈現降低趨勢，即破壁后的樣品溶液中總黃酮逐漸降低.這是因為辣木總黃酮在提取溶劑中的溶解度隨加水量的增加而增加所致，當加水量達到某一點時，提取率達到最大.但當繼續增大加水量時，辣木葉中水溶性物質不斷溶出，且提取液濃度降低，這些都不利于甚至會抑制辣木葉中總黃酮的滲出［24］.并且實際上在加水量為40 mL以上時，辣木葉粉在發酵過程中會出現了異味，不利于實驗的進行.綜合考慮后，最終確定加水量為30 mL較為合適.

2.2.3 培養時間 培養溫度控制為32 ℃，其他條件同2.1.2，改變培養時間，結果見圖4.由圖4可知，隨著培養時間的增大，破壁后的樣品溶液中吸光度先逐漸增大，當培養時間為3 d時，破壁后的樣品溶液的吸光度達到最大，即破壁后的樣品溶液中總黃酮的含量達到最高.當培養時間大于3 d時，破壁后的樣品溶液中吸光度呈現降低趨勢，即破壁后的樣品溶液中總黃酮逐漸降低.可能是因為提取時間過長，導致黃酮被氧化成其他物質，致使一部分黃酮丟失［25］.因此，綜合考慮培養時間選擇3 d作為培養時間為宜.

2.2.4 培養溫度 辣木葉粉中加水量為30 mL，其他條件同2.1.3，改變培養溫度，其實驗結果如圖5所示，由圖可知溫度對破壁后總黃酮含量的影響較為顯著.隨著培養溫度的增大，破壁后的樣品溶液中吸光度先逐漸增大，當培養溫度達到32 ℃時，破壁后的樣品溶液的吸光度達到最大，當培養溫度大于30 ℃時，破壁后的樣品溶液中吸光度呈現降低趨勢，即破壁后的樣品溶液中總黃酮逐漸降低.可能是因為干性酵母的最宜生長溫度在28～32 ℃，溫度過高或過低均不利于干性酵母的生長，從而導致破壁效果，并進一步影響辣木葉中黃酮的提取.因此，培養溫度選擇32℃為宜.

2.2.5 酵母發酵法最佳發酵條件下提取率 在上述最佳發酵條件下，經過實驗可得辣木葉中的總黃酮含量，通過與未經酵母發酵破壁處理的采用水提取法所得的辣木葉中總黃酮含量對比可知（見表1），經過酵母發酵破壁處理后的辣木葉中總黃酮的提取率遠大于未經酵母發酵破壁處理的水提取法的提取率.

表1 酵母發酵破壁與未破壁辣木葉粉提取率Tab.1 Extraction rate of moringa leaf powder broken and unbroken cell walls by yeast fermentation

2.3 Sephadex LH-20凝膠柱層析分離純化辣木葉多酚的工藝條件研究 目前多酚分離純化的較常用方法主要有大孔樹脂法和高效液相色譜法，其中大孔樹脂法以成本低、操作簡單、可行性強、分離效果較好等特點，成為當前分離純化多酚的較常用的方法之一.本文深入探討Sephadex LH-20凝膠柱層析分離純化工藝，以期為提高多酚的分離效果，獲得高純度的多酚類物質提供一定參考依據.

2.3.1 緩沖液濃度對辣木多酚的洗脫效果影響 以pH=4.0、10 mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液為過柱緩沖液，緩沖液濃度的分別為：10%、20%、30%檸檬酸-檸檬酸鈉對辣木多酚的洗脫效果分別如圖6a、圖6b、圖6c所示，當檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液濃度為20%時，各管的整體吸光度要優于另外兩組，即各管中的多酚含量普遍較高.綜合考慮：選擇20%檸檬酸-檸檬酸鈉作為緩沖液.

2.3.2 流速對辣木葉多酚的洗脫效果影響 以20%檸檬酸-檸檬酸鈉為洗脫劑，上樣量為10 mg，當洗脫流速分別為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1時，辣木葉多酚的洗脫效果如圖7 和圖8 所示.由圖可知，在0.5 mL·min-1的流速下洗脫效果最好.

2.3.3 上樣量對葡聚糖凝膠分離效果的影響 以20%檸檬酸-檸檬酸鈉為洗脫劑，洗脫流速為0.5 mL·min-1，當上樣量分別為10 mg、20 mg時，研究上樣量對葡聚糖凝膠分離純化效果的影響，其分離效果如圖9和圖10所示.由圖9和圖10可知，當進樣量為20 mg，多酚的分離效果最好.

3 結論

通過單因素得到酵母發酵破壁的最佳條件為：干性酵母添加量0.3%、辣木葉粉中加水量30 mL、發酵時間3 d、發酵溫度32℃.同時該破壁法有效地改善了辣木葉粉原有的辣澀味，與未破壁的辣木葉粉比較，酵母發酵破壁法得到的可溶性多酚較多.Sephadex LH-20 凝膠柱層析分離純化辣木葉多酚的工藝條件為：當以20%的酸化檸檬酸-檸檬酸鈉為洗脫液，在0.5 mL·min-1的流速下進行洗脫，進樣量為20 mg時，辣木多酚的分離效果最好.通過本文研究，以期為辣木中活性物質的進一步研發提供有利的依據.