三氧化硫吡啶法酯化修飾海參巖藻聚糖硫酸酯的研究

王瑞芳,陳發河,吳光斌,謝遠紅

(集美大學 食品與生物工程學院，福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門， 361021)

海地瓜是我國大宗低值海參品種，雖食用品質較差，但營養價值與刺參、梅花參等高品質海參相似，生理活性物質含量豐富[1]。目前海參加工產業增長速度雖快，但發展水平低，低值海參資源利用不充分、精深加工產品較少。對低值海參活性物質的深入研究，是充分利用海參資源、實現海參精深加工的關鍵科學問題。海參巖藻聚糖硫酸酯 (acaudina fucoidan，AFuc)是海地瓜體壁主要活性物質之一，具有抗輻射、增強免疫、抗氧化、增殖巨噬細胞等多種功能[2-4]。AFuc是一類主要由巖藻糖及硫酸基團組成的多糖，單糖組成及硫酸基團含量的不同會導致其抗凝血活性有較大差異[5]。張殉等[6]研究發現冰島刺參AFuc的硫酸酯化程度比海地瓜AFuc稍高一些，冰島刺參AFuc抑制腫瘤生長和轉移的作用也優于海地瓜AFuc，由此推測AFuc的抗腫瘤作用可能與高硫酸酯化程度有關。朱玉婕等[7]研究發現AFuc改善胰島素抵抗的效果與硫酸酯化位點、支鏈結構等分子特征密切相關，硫酸酯化位點多且無支鏈的AFuc的改善效果顯著。多糖的硫酸酯化修飾可提高其水溶性、增強負電荷、改變多糖的空間立體結構，從而使其生物學活性明顯改變[8-9]。選擇適宜的硫酸酯化劑對AFuc進行酯化處理以增強其生理活性，成為提高海地瓜AFuc物質經濟價值、促進低值海參資源高值化利用的有效途徑。

目前人們對不含硫酸基的多糖的酯化修飾做了大量研究工作[10-11]，而對含硫酸基的多糖的酯化修飾研究鮮見報道。海地瓜AFuc雖結構本身含硫酸基團，但硫酸酯化反應不僅增加硫酸基的含量，也可改變多糖分子結構，從而提高原有的生物活性，甚至增加新的功能[12]。故AFuc的硫酸酯化研究可為揭示AFuc的構效關系、研發高活性AFuc產品提供理論指導，進而拓寬其產業化應用范圍。目前多糖硫酸酯化常用的酯化劑有氯磺酸、濃硫酸和三氧化硫吡啶復合物，通過酯化可使單糖殘基上的羥基連接上硫酸基團[13-14]。氯磺酸法操作困難、反應劇烈、危險性大，濃硫酸法易導致多糖碳化，三氧化硫吡啶復合物法反應溫和、易于操作，且效果較好。硫酸酯化常用的溶劑有N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶和二甲基亞砜(DMSO)，但有研究發現DMSO不適宜用作多糖硫酸酯化溶劑[15]。本文擬以海地瓜AFuc為原料，采用三氧化硫吡啶復合物法對其進行硫酸酯化，以硫酸基取代度為指標設計正交試驗，確定DMF和吡啶兩種不同溶劑下的最佳酯化工藝參數，并對酯化產品進行紅外光譜分析和抗氧化活性的測定。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

AFuc粗品(純度為56.12%，硫酸基取代度為0.83)，為本實驗室自制[16]；N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、三氧化硫吡啶復合物(C5H5N·SO3)、明膠、NaOH、K2SO4、乙醇等試劑，均為分析純。

1.2 儀器設備

WCT-200型磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；KDC-1044型低速離心機，科大創新股份有限公司；FT/IR-480型傅里葉紅外光譜儀，日本島津公司；Cary50型紫外可見分光光度計，美國Varian公司；JDG-0.2B型真空冷凍干燥機，蘭州科近真空凍干技術有限公司。

1.3 海參巖藻聚糖硫酸酯的酯化

1.3.1 三氧化硫吡啶復合物/N,N-二甲基甲酰胺法(C5H5N·SO3/DMF法)

將15 mL吡啶加入錐形瓶中，磁力攪拌下加入一定量的C5H5N·SO3，熱水浴加熱至反應溫度，再加入AFuc產品0.2 g，保溫反應。反應完畢后冷卻至室溫，用2 mol/L的NaOH溶液調至中性，蒸餾水透析72 h，旋蒸濃縮10倍后加入3倍體積95%的乙醇，4 ℃下靜置過夜，收集沉淀冷凍干燥，得硫酸酯化海參巖藻聚糖硫酸酯(sulfated acaudina fucoidan，SAFuc)產品。

在單因素試驗基礎上，選定反應溫度、酯化劑用量、反應時間3個參數為影響因素，每個因素取3個水平，設計正交試驗L9(33)。

1.3.2 三氧化硫吡啶復合物/吡啶法(C5H5N·SO3/C5H5N法)

將15 mL吡啶加入錐形瓶中，磁力攪拌下加入一定量的C5H5N·SO3，熱水浴加熱至反應溫度，再加入AFuc產品0.2 g，保溫反應。反應完畢后冷卻至室溫，用2 mol/L的NaOH溶液調至中性，蒸餾水透析72 h，旋蒸濃縮10倍后加入3倍體積95%的乙醇，4 ℃下靜置過夜，收集沉淀冷凍干燥，得SAFuc產品。

在單因素試驗基礎上，選定反應溫度、酯化劑用量、反應時間3個參數為影響因素，每個因素取3個水平，設計正交試驗L9(33)。

1.4 產品分析鑒定

采用明膠-比濁法[17-18]測定硫酸基的質量百分數S%，然后按公式(1)計算硫酸基取代度(degree of substitution，DS)。

(1)

紅外光譜分析：稱取1 mg干燥產品與適量溴化鉀成均勻粉末，然后用壓片機壓片，形成透明薄片，在500～4 000cm-1進行紅外掃描，測定其紅外光譜圖。

1.5 產品抗氧化活性的測定

DPPH體系法[18-19]測定清除1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)的能力；

Fenton反應體系法[20-21]測定清除羥基自由基(·OH)的能力。

2 結果與分析

2.1 C5H5N·SO3/DMF法反應結果

2.1.1 單因素試驗結果

C5H5N·SO3在DMF中的溶解性較好，常溫下可溶解，反應過程可常溫操作。考察了DMF為溶劑時反應溫度、酯化劑用量、反應時間對硫酸酯化效果的影響，結果如圖1所示。

A-反應溫度；B-CSH5N·SO3用量；c-反應時間圖1 DMF為溶劑時反應溫度(A)、C5H5N·SO3用量(B)和反應時間(C)對產物取代度的影響 Fig.1 Effects of reaction temperature, C5H5N·SO3 dosage and time on DS of DMF as solvent

圖1-A顯示，溫度低于50 ℃時，隨著反應溫度的增加，產物取代度逐漸升高；60 ℃時，取代度略有下降。在一定溫度范圍內，隨反應溫度的上升，分子運動加快，取代反應的幾率增加。但溫度過高也會導致多糖的降解及結構的破壞，所以取代度先上升后下降；圖1-B表明，30 ℃下反應1 h，取代度隨著酯化劑用量的增加而上升，說明隨著硫酸鹽濃度的升高，硫酸基團和多糖間的結合逐漸增多[22]，故酯化劑用量越高越利于酯化反應的進行，但酯化劑用量越高成本越高；圖1-C顯示，反應溫度30 ℃下，在2 h內取代度隨反應時間的增加而增加，超過2 h取代度呈下降趨勢，過長的反應時間不利于酯化，這說明過長的反應時間會導致多糖的降解及結構的破壞。同時酯化時間過長也會增加經濟成本，故反應時間以2 h為宜。

2.1.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法確定C5H5N·SO3/DMF法的最適條件，各因素水平及實驗結果列于表1。

由表1可以看出，運用C5H5N·SO3/DMF法進行AFuc的酯化修飾，影響酯化反應因素的主次順序為B>A>C，即酯化劑用量對酯化度影響最大，其次是反應溫度和反應時間。最佳工藝組合為A1B3C3，即反應溫度為40 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應時間為3 h時酯化效果最好，產品取代度可達15.63(該產品編號為SAFuc-1)。為進一步考察優化工藝的可靠性和穩定性，稱取3批各0.2 g AFuc產品按上述最佳工藝條件進行驗證試驗，結果產品取代度為14.87±1.13，說明該工藝條件下，產品取代度較高。驗證試驗結果表明，該優選工藝穩定可靠。

表1 DMF為溶劑時正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal experiment design and results of DMF as solvent

2.2 C5H5N·SO3/C5H5N法酯化反應結果

2.2.1 單因素試驗結果

C5H5N·SO3在吡啶中溶解性較差，常溫下酯化劑不溶解，必須加熱至60 ℃才可溶解。同樣考察了吡啶為溶劑時反應溫度、酯化劑用量、反應時間對硫酸酯化效果的影響，結果如圖2所示。

A-反應溫度；B-C5H5N·SO3用量；C-反應時間圖2 吡啶為溶劑時反應溫度、C5H5N·SO3用量和反應時間對產物取代度的影響Fig.2 Effects of reaction temperature, C5H5N·SO3 dosage and time on the degree of substitution of pyridine as solvent

圖2-A顯示，隨溫度的上升，取代度逐漸增加，高溫利于酯化。可能原因在于，隨反應溫度的上升，C5H5N·SO3在吡啶中的溶解性越好，分子運動也越快，更利于取代反應；圖2-B顯示，90 ℃下反應1 h，取代度隨著酯化劑用量的增加而顯著增加，同樣是因為隨著硫酸鹽濃度的升高，硫酸基團和多糖間的結合逐漸增多從而使取代度增大，但高溫條件下，酯化劑用量過高也會使多糖結構發生破壞[22]。圖2-C表明，反應溫度90 ℃下，隨著反應時間的增加，硫酸基取代度先升高后有所下降。在3 h內，酯化時間增加，有助于酯化反應的進行；但在高溫條件下，酯化時間過長，也會引起多糖的部分降解，導致取代度有所下降。

2.2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法確定C5H5N·SO3/C5H5N法的最適條件，各因素水平及實驗結果列于表2。

表2 吡啶為溶劑時正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experiment design and results of Py as solvent

表2顯示，運用C5H5N·SO3/C5H5N法進行AFuc的酯化修飾，影響酯化反應因素的主次順序為B>A>C，即酯化劑用量對酯化度影響最大，其次是反應溫度和反應時間。最佳工藝組合為A3B3C2，即反應溫度為90 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應時間為3 h時酯化效果最好，產品取代度可達13.31(該產品編號為SAFuc-2)。為進一步考察優化工藝的可靠性和穩定性，稱取3批各0.2 g AFuc產品按上述最佳工藝條件進行驗證試驗，結果產品取代度為13.11±1.25，說明該工藝條件明顯優于正交試驗的其他組。驗證試驗結果表明，該優化工藝也是穩定可靠的。

2.3 紅外光譜分析

圖3 AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of AFuc, SAFuc-1 and SAFuc-2

2.4 AFuc和SAFuc的抗氧化活性

測定質量濃度為2 mg/mL的AFuc和SAFuc溶液對DPPH·及·OH的清除效果，結果如圖4所示。圖4顯示AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2溶液對DPPH·的清除效果高于·OH； AFuc酯化修飾后對DPPH·和·OH的清除效果均顯著增強，且SAFuc-1(取代度15.63)對DPPH·和·OH的清除效果均優于SAFuc-2(取代度13.31)，說明硫酸基團的增加利于AFuc抗氧化活性的提高。該結論與不含硫酸基的多糖(如魚腥草多糖[25]、懷山藥多糖[26]等)硫酸酯化修飾后抗氧化活性測定結果一致。謝明勇等[27]分析了硫酸酯化改變抗氧化活性的原因在于：硫酸基團的引入使得多糖的構象變得更為伸展，改變了多糖在溶液中的構象，從而利于其活性的表達。與氯磺酸吡啶法相比，C5H5N·SO3為酯化劑所得產品的硫酸基含量雖低，但抗氧化活性卻更高[17-18]，可能原因在于：酯化反應條件不同，對多糖空間構象的改變影響不同。

圖4 AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2對DPPH·和·OH的清除效果Fig.4 Scavenging effect on DPPH· and ·OH of AFuc,SAFuc-1 and SAFuc-2

3 結論

采用C5H5N·SO3為酯化劑可有效對AFuc進行酯化改性，且在DMF和吡啶兩種不同溶劑下，影響酯化效果的諸因素主次順序均為：酯化劑用量影響最大，其次是反應溫度、反應時間。DMF為溶劑時最佳酯化工藝條件為：反應溫度為40 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應時間為3 h，硫酸基的取代度由0.83提高至15.63；吡啶為溶劑時最佳酯化工藝條件為：反應溫度為90 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應時間為3 h，產品取代度提高至13.31。紅外光譜檢測表明，SAFuc在硫酸酯處的特征吸收峰明顯加強；抗氧化活性測定顯示，酯化反應后，產品抗氧化活性提高?？傮w而言，DMF為溶劑時，酯化反應條件溫和、硫酸基取代度較高，且產品抗氧化活性更優，故C5H5N·SO3/DMF法更適于AFuc的酯化反應，是一種很有應用前景的硫酸酯化多糖的方法。本試驗為低值海參的高值化開發應用提供了科學依據，為豐富多糖構效關系、拓寬多糖的應用領域研究提供了理論基礎。