一株強化發酵甜瓣子的乳酸片球菌特性及應用效果評價

鄧維琴，李雄波，張其圣,2，陳功,2，范智義，胡廷，李恒,2,3*

1(四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都， 611130)2(四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山， 620030)3(成都市丹丹川菜調味品產業研究院有限公司，四川 成都， 611730)4(成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都， 610106)

郫縣豆瓣是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，食用鹽、小麥粉等為輔料釀制而成的傳統調味品。其生產工藝主要包括制曲、甜瓣子發酵、辣椒醅發酵及后發酵生香等階段[1]。原料中豐富的營養成分在甜瓣子發酵過程中形成各種風味物質，對成品品質有突出貢獻，甜瓣子發酵是郫縣豆瓣風味形成的關鍵階段。甜瓣子發酵過程中米曲霉、芽孢桿菌、乳酸菌以及酵母菌是主要發酵菌株，乳酸菌對豆瓣醬風味的呈現有著重要作用[2-6]。

乳酸菌是發酵食品中常用的益生菌，其發酵過程中可產生有機酸[7]、芳香化合物[8]、酶[9]以及胞外多糖[10]等多種物質，并為發酵體系提供有機酸、雙乙酰、過氧化氫及細菌素等多種活性物質，有效增強感官品質、抑制不良微生物、延長產品保質期[11-13]。目前，傳統發酵醬中乳酸菌的篩選和應用已成為領域的研究熱點。CUI等[14]從黃豆醬中篩選了28種嗜鹽乳酸菌，利用篩選的嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)結合酵母菌對黃豆醬進行強化發酵，可增加產品中揮發性風味物質含量；陳伯林[15]研究發現在醬油發酵第6天添加0.25%的乳酸菌進行發酵，可顯著改善醬油的風味，提高醬油中乳酸含量；WANG等[16]發現在醬醅發酵第15天接種乳酸菌，醬醅發酵第45天接種酵母菌，可提高醬油中揮發性風味物質的含量；IWASAKI等[17]研究了氧化鋁陶瓷固定化乳酸菌在醬油發酵中的應用，固定化的嗜鹽片球菌(Pediococcushalophilus)可使醬醅壓榨液中的乳酸含量達到7～9 g/L。

乳酸菌在豆瓣醬-甜瓣子發酵中的應用也逐漸受到學者的關注。VEMI等[18]研究發現乳酸菌添加到蠶豆醬中可提高肽酶、β-葡糖苷酶、胞外多糖、抑菌物質等代謝產物的含量，明顯提高蠶豆醬品質。李從虎等[19]在甜瓣子發酵階段接種耐鹽乳酸菌滬釀1.08和酵母菌，甜瓣子中主要呈香物質及高級脂肪酸的含量得到顯著提升。乳酸菌強化可加快營養物質代謝，促進發酵，改善甜瓣子風味。然而，目前還沒有一種強化甜瓣子發酵的專用乳酸菌及菌劑。本研究從傳統發酵甜瓣子中篩選優勢耐鹽乳酸菌，研究其生長特性，并制備乳酸菌劑，研究乳酸菌劑強化發酵甜瓣子的效果，以期提供一種甜瓣子發酵專用的乳酸菌劑，為其在甜瓣子發酵體系的應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株篩選原料

傳統發酵甜瓣子，四川省丹丹郫縣豆瓣公司。

1.1.2 試劑及培養物

TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒、無水乙醇、氫氧化鈉溶液、甲醛溶液、乳酸菌選擇性培養基(改良MRS培養基)，上海艾研生物科技有限公司；27F引物、1492R引物、MIX酶、超純水、250 bp Maker、瓊脂糖，上海慧穎生物科技有限公司；0.05 mol/L HCL溶液。

1.2 儀器與設備

LGJ-500型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠有限公司；SWDB204SD-01型分離機，北京中船綠洲機器有限公司；752G紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器股份有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；BCD-201MLT冰箱，合肥美菱股份有限公司；PV1189-型發酵罐，鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司；H2050R-1離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHSJ-4型pH計，上海儀電分析儀器股份有限公司；T960A智能梯度PCR儀，杭州晶格科學儀器有限公司；高效液相色譜儀，Agilent 1260；443D，氨基酸分析儀，德國Sykam。

1.3 試驗方法

1.3.1 產酸能力強的乳酸菌分離鑒定

1.3.1.1 菌株分離

稱取10 g甜瓣子至盛裝有90 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，混勻、逐次稀釋，采用MRS固體培養基(加入2% CaCO3)傾注，每個梯度3個平行，37 ℃培養24 h。挑取疑似乳酸菌形態的單菌落純化，逐步傳代劃線分離純化至菌株在MRS培養基上大小形態一致。根據MRS CaCO3平板中透明圈的大小初步篩選得到4株典型產酸能力強的乳酸菌，分別編號為ND1、ND2、ND3、ND5，于MRS培養基斜面劃線，37 ℃培育24 h，4 ℃保藏。

1.3.1.2 菌株生長曲線測定

分別挑取ND1、ND2、ND3、ND5單菌落接種于100 mL MRS液體培養基中，培養12 h，得到種子液。分別吸取1 mL ND1、ND2、ND3、ND5的種子液至100 mL無菌MRS肉湯培養基中，菌株接種濃度為107CFU/mL，每組3個平行。定時取樣，測定發酵液在610 nm條件吸光值。

1.3.1.3 產酸能力測定

分別吸取1 mL ND1、ND2、ND3、ND5的種子液至100 mL無菌MRS肉湯培養基中，菌株接種濃度為107CFU/mL，37 ℃培養24 h。參照GB/T 12456—2008方法，采用標定后的NaOH 溶液(約0.049 mol/L)進行滴定，計算發酵液總酸含量，同時記錄發酵終點pH值，每組3個平行。

1.3.1.4 優勢菌株形態及16S rRNA測序

采用MRS培養基平板劃線分離純化后，進行革蘭氏染色顯微鏡觀察形態，記錄菌落形態，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊(第8版)》進行初步鑒定。

挑取優勢菌株單菌落接入100 mL MRS肉湯培養液中，37 ℃培養24 h后，采用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)提取細菌DNA。PCR擴增16S rRNA片段，PCR擴增反應的體系為：1 μL 27 F引物，1 μL 1 492 R引物，3 μL DNA模板，MIX酶12.5 μL，超純水12.5 μL，共30 μL。擴增程序為：預變性94 ℃、4 min，變性94 ℃、1 min，退火60 ℃、45 s，延伸72 ℃、90 s，末端延伸72 ℃、10 min，變性、退火、延伸30次循環。將擴增物送北京擎科生物有限公司測序，得到的序列通過BLAST比對，采用Mega 5.0建立系統發育樹進行分子生物學鑒定。

1.3.2 菌株ND1的生長特性

1.3.2.1 不同鹽度條件生長情況

根據測定結果篩選出產酸能力和生長能力最強的菌株ND1進行深入研究。挑取菌株ND1的單菌落接入100 mL MRS培養液中，培養12 h后作為種子液。吸取1 mL種子液加入100 mL不同NaCl濃度的MRS培養液中，培養液中NaCl質量分數分別為3%、5%、8%、10%。接種濃度約為107CFU/mL，37 ℃培養，每組3個平行，定時取樣測定OD610。

1.3.2.2 不同酸性條件生長情況

吸取1 mL菌株ND1種子液于100 mL不同pH值的MRS培養液中，培養液中接種濃度約為107CFU/mL，培養液初始pH值分別為3.5、4、4.5、5、6，每組3個平行，37 ℃培養，定時取樣測定OD610。

1.3.2.3 不同溫度條件生長情況

吸取1 mL ND1種子液于100 mL MRS培養液中，培養液中接種濃度約為107CFU/mL，分別在4、10、20、30、37、45、50 ℃ 條件培養，每組3個平行，定時取樣測定培養液OD610。

1.3.3 乳酸菌劑制備

挑取ND1單菌落接種至30 mL MRS液體培養基中活化，37 ℃培養18 h；將活化液轉移至3 L MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h得到種子液。采用500 L發酵罐擴大培養，調整MRS液體培養基pH至 6.0，接入3 L種子液，37 ℃培養18 h，發酵液稀釋10倍后OD610達到1.8左右。發酵原液低溫離心得到菌體，按1∶1(g∶mL)加入20%海藻糖保護劑后，采用冷凍干燥機干燥48 h得到菌劑。

1.3.4 產香乳酸菌劑中活菌計數

準確稱取1.3.3制得的乳酸菌菌劑1 g，與99 mL無菌水(加入適量玻璃珠)充分混勻后，得到10-2g/mL稀釋液。逐次稀釋，選擇適宜濃度的稀釋液進行傾注，混勻，37 ℃培養24 h，計數培養皿中的菌落數，并由此計算菌粉中的活菌數。

1.3.5 乳酸菌劑強化發酵甜瓣子

將霉豆瓣與鹽水按1∶1比例混合，加入質量分數15%的鹽和適量乳酸菌劑，乳酸菌接種量為107CFU/g，攪拌混勻，37 ℃發酵60 d。以不添加乳酸菌劑的甜瓣子發酵組為空白組，試驗組和空白組分別設置3個平行。

1.3.6 強化發酵甜瓣子品質分析

總酸、氨基酸態氮含量參考GB 5009.235—2016測定；甜瓣子中氨基酸的測定參考GB5009.124—2016進行測定；甜瓣子中有機酸含量參考GB5009.157—2016測定。

2 結果與分析

2.1 高效乳酸菌的篩選

初篩得到的4株乳酸菌生長曲線如圖1所示。菌株ND1在24 h內生長最為迅速，生長量高于其他菌株，而菌株ND3生長速度最緩慢。

圖1 菌株ND1、ND2、ND3、ND5在24 h內生長曲線Fig.1 Growth curve of the four strains in 24 h

將菌株ND1、ND2、ND3、ND5接種于MRS液體培養基中，37 ℃發酵24 h后測定乳酸含量，測定結果如圖2所示。培養24 h后，菌株ND1發酵液中乳酸含量為1.296 g/100g，ND2發酵液乳酸含量為1.263 g/100g，菌株ND3發酵液乳酸含量為0.977 g/100g，菌株ND5發酵液乳酸含量為1.211 g/100g。菌株ND1產乳酸能力高于其他菌株。根據以上結果篩選得到產酸能力最強，生長繁殖能力最強的菌株ND1為后續研究菌株。

圖2 菌株ND1、ND2、ND3、ND5產總酸量Fig.2 The concentration of total acid in the fermentationbroth of the four strains注：圖中不同字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態

將菌株ND1在MRS固體培養基平板上劃線培養，37 ℃培育24 h，觀察其在MRS培養基上的形態特征，革蘭氏染色后觀察細胞形態。圖3為其菌落形態及顯微形態。菌落呈圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，菌落較小。革蘭氏染色呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下形態為小球形，對生，四聯，無芽孢。

圖3 菌落形態及顯微形態照片Fig.3 Colonial and cellular morphology of strain ND1

2.2.2 分子生物學鑒定

進化樹結果(圖4)顯示菌株ND1與乳酸片球菌標準菌株PediococcusacidilacticiDSM 20284(AJ305320.1)聚為一個分支，相似度高，再結合形態特征，初步鑒定ND1為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

圖4 菌株ND1系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain ND1

2.3 優勢菌株ND1的生長特性

2.3.1 優勢菌株ND1不同酸性條件下的生長情況

圖5為ND1在不同酸性條件的生長情況，菌株ND1在培養基初始pH為5和6條件下生長速度最快，迅速進入對數生長期，10 h后進入穩定期，此后OD值基本維持穩定。初始培養基酸度越大，ND1生長速率越緩慢，在初始pH 3.5～4.5條件下均能良好生長。初始pH值為3.5時，ND1生長極為緩慢，培養8 h后開始緩慢生長，培養24 h 后OD610為0.448。

圖5 菌株ND1不同pH條件下的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain ND1 in MRS medium with different pH

2.3.2 優勢菌株ND1不同鹽度條件下的生長情況

甜瓣子發酵鹽度一般為10%～14%(質量分數)，因此菌株耐鹽能力對其后期的應用極其重要。本試驗篩選的菌株ND1在NaCl濃度為3%、5%、8%條件下均能生長。鹽度越高，菌株生長速度越緩慢，NaCl為10%的條件生長極為緩慢，生長情況如圖6所示。菌株ND1能耐受10%的NaCl，在NaCl濃度為8%的條件下能緩慢生長，在3%和5%條件下長勢與對照組相同，生長量低于對照組。

圖6 菌株ND1不同鹽度下的生長曲線Fig.6 Growth curve of strain ND1 in MRS medium with different concentration of NaCl

2.3.3 優勢菌株ND1不同溫度條件下的生長曲線

溫度是影響菌株生長和發酵甜瓣子的重要因素，目前豆瓣醬發酵多屬于常溫發酵(發酵池溫度從冬天到夏天溫度變化大，在8～40 ℃)，冬天發酵溫度低導致甜瓣子發酵速度極其緩慢。因此菌株能否在廣譜溫度條件下生長對菌株在豆瓣醬中的應用具有重要意義。圖7是菌株ND1在高溫條件的生長情況，菌株ND1在30、37、45、50 ℃下均能生長，45 ℃條件下生長速度最快。菌株ND1在37 ℃和45 ℃長勢相同，2 h開始進入對數期，在10 h后進入穩定期，穩定期生長量最大，OD610約為1.732。圖8為菌株ND1在低溫條件的生長情況，菌株在試驗組低溫條件下均能生長，但生長速度緩慢。菌株ND1在10 ℃和20 ℃培養條件下生長趨勢相同，在9 h開始進入對數期，在48 h后增長速度變緩，146 h開始進入穩定期。菌株ND1在4 ℃培養條件下，遲滯期較長，能緩慢生長。綜上，乳酸片球菌ND1在4～50 ℃條件均能生長，能在廣譜溫度范圍內生長。高溫條件更利于菌株ND1的生長，其在37～45 ℃生長速度最快，生長量最大。菌株ND1在低溫(4～20 ℃)條件也能生長，這為菌株在低溫發酵食品的使用提供了可能性。

圖7 ND1在高溫條件生長曲線Fig.7 Growth curve of strain ND1 in MRS medium at different temperature(high temperature)

圖8 ND1在低溫條件生長曲線Fig.8 Growth curve of strain ND1 in MRS medium at different temperature(low temperature)

2.4 乳酸菌劑制備效果

采用500 L發酵罐擴大培養18 h，發酵液稀釋10倍后OD610達到1.8左右。發酵原液低溫離心得到菌泥，1∶1(g ∶mL)加入10%(質量分數)海藻糖保護劑后，采用冷凍干燥機干燥48 h，得到約1.5 kg菌粉，菌粉呈白色粉末狀，乳酸菌活菌數為1.07×1012CFU/g。發酵菌劑得率高，活菌濃度大，利于推廣應用。

2.5 乳酸菌劑強化發酵甜瓣子品質評價

2.5.1 氨基態氮和總酸含量分析

添加ND1乳酸菌劑發酵60 d的甜瓣子氨基態氮含量為0.804 g/100 g，總酸含量為2.849 g/100g；對照組氨基態氮含量為0.807 g/100g，總酸含量為2.023 g/100g。ND1乳酸菌劑對氨基態氮含量的影響較小，而對總酸含量的生成有促進作用，添加ND1菌劑的甜瓣子總酸含量略高于對照組。

2.5.2 氨基酸含量分析

由表1可知，添加ND1乳酸菌劑發酵的甜瓣子中氨基酸的組成與對照組相似，氨基酸總量(相對百分含量)分別為13.25%和13.12%。谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸為主要氨基酸。乳酸菌劑強化不影響甜瓣子發酵體系氨基酸的組成。

表1 乳酸菌劑ND1發酵甜瓣子中氨基酸含量統計 單位：%

注：t檢驗P<0.05表示樣品間差異顯著，不同字母代表差異顯著(下同)

2.5.3 有機酸含量分析

由表2可知，乳酸菌劑ND1促進有機酸的形成，ND1強化發酵組有機酸總量為27.08 mg/g，而空白組有機酸總量為19.63 mg/g。甜瓣子中乙酸、乳酸、蘋果酸、丁二酸、檸檬酸為主要的有機酸，以乙酸含量最為突出，分別為15.00和9.50 mg/g。乳酸菌劑ND1強化發酵甜瓣子對乙酸、乳酸、蘋果酸的增強作用最明顯，其中乳酸含量由空白組的1.86 mg/g增加到2.17 mg/g，蘋果酸由空白組的2.15 mg/g增加到3.71 mg/g，乙酸含量由空白組的9.50 g/mg增加到15.00 mg/g。

表2 乳酸菌劑ND1發酵甜瓣子中有機酸含量統計 單位：mg/g

3 討論

乳酸菌是發酵醬中重要的有益微生物。目前，乳酸菌尤其是四聯球菌被廣泛應用于發酵醬的增香，可明顯提高醬中有機酸、乙酸、甲酸、糠醛、糠醇等風味物質的含量[20]。WU 等[21]采用四聯球菌強化發酵豆瓣醬，豆瓣醬中氨基態氮、酸類、醇類等揮發性成分均有所提高，而亞硝酸鹽含量減少了39.4%。關統偉等[24]研究表明乳酸片球菌在甜瓣子發酵過程中相對含量較高，是甜瓣子發酵過程中優勢細菌。乳酸片球菌一般能耐受9%～10%的鹽，耐鹽能力較強[25]。乳酸片球菌可通過代謝葡萄糖、果糖、甘露糖等物質產有機酸，增強風味，還能產生胞外多糖[26]。乳酸片球菌能合成片球菌素，被廣泛的用作天然抑菌劑[27-28]。乳酸片球菌的環境適應能力更強，生長速度更快，因此采用乳酸片球菌用于甜瓣子強化發酵具有明顯優勢。

本研究篩選得到的乳酸片球菌ND1具有良好的溫度、酸度、鹽度適應性，其生長能力及環境耐受能力明顯高于目前已報道的發酵醬中篩選出的乳酸菌[29]。菌株ND1在低溫條件(4～10 ℃)也能緩慢生長，這為菌株在低溫發酵食品的使用提供了可能性[30]。乳酸片球菌ND1在發酵罐中易培養，發酵得到的乳酸菌菌劑活菌數可達1.07×1012CFU/g。產品得率較高，利于其在甜瓣子發酵企業的推廣應用。將乳酸片球菌ND1菌劑添加于甜瓣子發酵階段，甜瓣子的有機酸含量得到明顯提高，尤其是乙酸、蘋果酸、乳酸的含量得到明顯提升。因此，甜瓣子中乳酸片球菌ND1菌劑的添加可達到調控產品有機酸組成及風味的目的。

4 結論

從傳統發酵甜瓣子中篩選得到1株產酸能力強、生長迅速的乳酸片球菌ND1。乳酸片球菌ND1具有良好的溫度、鹽度、酸度適應性，其生長能力及環境耐受能力明顯高于已報道的發酵醬中篩選出的乳酸菌。菌株繁殖能力強，擴大培養制備菌劑活菌得率高，為其推廣應用提供了優勢。利用乳酸片球菌ND1菌劑強化發酵甜瓣子，可有效提高有機酸尤其是乙酸、蘋果酸、乳酸的含量。采用乳酸片球菌強化發酵甜瓣子具有明顯優勢，菌劑制備高活菌數的方法為其工業推廣應用提供了保障。