貯藏溫度對‘Tarocco’血橙花色苷積累及抗氧化活性的影響

馮雨，賀明陽,2，王晶，王日葵*，傅云梅，洪敏

1(西南大學柑桔研究所，重慶，400712)2(中國科學院華南植物園植物資源保護與可持續利用重點實驗室，廣東 廣州，510650)

血橙屬甜橙類，其種植起源于歐洲。我國種植的血橙品種有路比(Ruby)、塔羅科(Tarocco)、桑吉耐洛(Sanguinello)、摩洛(Moro)等，主要從意大利、西班牙等國家引進[1]。目前，我國種植面積最廣的是‘Tarocco’血橙[2]。血橙因富含多酚、類黃酮、抗壞血酸等具有抗氧化活性的物質，深受消費者喜愛。血橙是唯一含花色苷的柑橘，花色苷的積累使其果實呈現特有的紫紅色[3]。花色苷是一種天然水溶性色素，屬于黃酮類化合物[4]。花色苷是血橙中主要的抗氧化活性成分，具有極強的抗氧化性，可有效地清除羥自由基[5]、增強植物抗脅迫能力[6]。花色苷還對人體具有許多生理保健功能，如抗衰老、預防肥胖癥、抗炎癥[7-8]。因此，探究采后處理對血橙花色苷積累和抗氧化活性的影響具有重大意義。

溫度對花色苷的積累有一定的影響[9-12]。SHINOMIYA等[9]對葡萄進行采前低溫結合光照處理，花色苷合成途徑的關鍵基因UFGT達到最高水平表達，從而促進花色苷積累，使得果皮色澤更加誘人。CARMONA等[10]報道在4 ℃和9 ℃下貯藏‘Moro’血橙均能增加花色苷的含量，且進一步研究發現，在9℃條件下可誘導血橙中花色苷合成相關的結構基因上調幅度顯著，其中DFR/FLS遠大于在4 ℃條件下貯藏，使二氫黃酮醇代謝途徑更加偏向于生成花色苷的方向。PANNITTERI等[11]發現‘Tarocco’血橙在4 ℃下貯藏70 d花色苷的含量明顯高于對照組(20 ℃)，但在1 ℃時貯藏20 d，血橙中花色苷含量沒有明顯的變化。而TSANIKLIDIS等[12]研究發現甜櫻桃在1℃下貯藏，其花色苷含量低于對照組(20 ℃)，進一步研究得到，生成花色苷途徑的結構基因ANS和UFGT表達降低。因此，在溫度過低的情況下，反而抑制花色苷合成途徑的基因表達，不利于果實中花色苷的積累。

由此可知，適宜的貯藏溫度能更有效地增加果實中花色苷含量。目前，國內外對低溫誘導花色苷合成的研究報道不少，但對于低溫誘導血橙花色苷合成，同時維持果實的良好品質有待進一步研究。本實驗擬通過不同溫度貯藏‘Tarocco’血橙，探究貯藏溫度對血橙花色苷合成規律及血橙果肉中的總酚、總黃酮含量和酶活性的變化規律，篩選出適宜血橙貯藏的溫度，有利于提高血橙營養價值及商品價值，并為采后血橙品質調控提供理論依據及可行技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血橙品種為‘Tarocco’血橙，2019年2月26日下午在重慶市萬州區血橙基地采摘，次日運回北碚區實驗室。挑選出大小均勻，表面無損傷，無病害的果實，并用500 mg/L咪鮮胺溶液和250 mg/L 2,4-D溶液浸泡1 min，取出晾干備用。

乙酸鈉(優級純)，上海麥克林生物公司；Al(NO3)3(分析純)，冰醋酸(優級純)，成都市科隆化學品有限公司；愈創木酚(化學純)，中國佘山化工廠；NaNO2、鄰苯二酚、PEG 6000(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；福林酚試劑(生物試劑)，生工生物工程股份有限公司；兒茶素標準品和沒食子酸標準品，南通飛宇生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀，成都立德賽科技有限公司；CF16RN高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HZK-FA210S電子天平，福州華志科學儀器有限公司；CM-5分光色差儀，柯尼卡美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將晾干的血橙單果包裝隨機分在不同溫度下貯藏。溫度的選擇參考相關文獻[10-11]得出，并結合實際情況作相應調整：對照組，15～20 ℃、80%～85% RH(CK)；處理組1，6～8 ℃、80%～85% RH(T1)；處理組2，4～6℃、80%～85% RH(T2)，每組約300個果實，分別在空間大小都一致、且處于無光照條件下的冷庫室及通風室內貯藏。每隔15 d隨機取樣1次，每組取15個果實進行各項指標測定，3個生物學重復。最后，果肉用液氮速凍后置-80 ℃的冰箱備用。

1.3.2 色差測定

柑橘榨汁，過濾混合后取樣，根據CIEL*、a*、b*參數采用CM-5色差儀于室溫下測得。參考CHEN[13]等采用色澤指數(citrus color index，CCI)表示柑橘果汁顏色變化。CCI值為正則表示紅黃色，為負表示藍綠色，值的絕對值越大代表顏色越深；為零表示紅，黃和藍綠復合色。CCI計算如公式(1)所示：

(1)

式中：L*為亮度；a*為紅綠色差；b*為黃藍色差。

1.3.3 花色苷含量測定

采用pH示差法[14-15]。使用兩種緩沖液，pH=1.0的KCl緩沖液和pH=4.5的乙酸鈉緩沖液。用相應的緩沖液(1∶6)稀釋樣品，于510 nm和700 nm處測定吸光度。

1.3.4 總酚含量和總黃酮含量測定

液氮研磨冷凍的血橙果肉樣品，稱取2 g粉末，加入80%甲醇10 mL，渦旋混勻，室溫超聲30 min，然后將混合液離心(22 ℃、5 000×g、10 min)，取上清液到25 mL容量瓶中，殘渣重提1～2次，將所有上清液用80%甲醇定容于25 mL容量瓶中，混合后溶液置于5 mL離心管中，低溫保存備用。

總酚含量測定：參考季露等[16]方法并略作修改。采用Foiln-Ciocalte法，用沒食子酸作標準物。準確取待測樣品溶液0.3 mL，加入1.2 mL蒸餾水，再加入福林酚試劑0.3 mL，混勻后暗反應6 min，再加入3 mL 7%Na2CO3、2.4 mL蒸餾水，室溫靜置90 min，于760 nm下測定吸光度，重復3次。以每克果蔬樣品干重相當于沒食子酸的毫克數。

總黃酮含量測定：參考季露等[16]和張東峰等[17]方法并略作修改。用兒茶素做標準物。準確稱取待測溶液0.6 mL、2.4 mL 80%甲醇、0.3 mL 5%NaNO2溶液，混勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min，最后加入2.4 mL 4%NaOH溶液，混勻靜置15 min，于510 nm下測吸光度，重復3次。以每克果蔬樣品干重相當于兒茶素的毫克數。

1.3.5 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定

稱取5 g血橙果肉凍樣，置于預冷的研缽中，加入5 mL提取緩沖液(1 mmol聚乙二醇6 000、4%聚乙烯吡咯烷酮和1%Triton X-100)，在冰浴下研磨成勻漿，于4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液，即為酶提取液，放置4 ℃低溫保存備用。

PPO活性測定：參考ZHOU等[18]方法略作修改，取一支干凈試管，向其加入4.0 mL 0.1 mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 100 mmol/L鄰苯二酚溶液，再加入1 mL酶提取液，立即混合均勻，在波長420 nm測吸光度，重復3次。以每克果蔬樣品在420 nm處每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個PPO活性單位。

POD活性測定：參考CHANCE等[19]方法略作修改，取一支干凈試管，向其加入3 mL 25 mmol/L愈創木酚溶液、0.5 mL酶提取液，再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合后啟動反應，在波長470 nm測吸光度，重復3次。以每克果蔬樣品在470 nm波長每分鐘吸光度變化值增加1為1個POD活性單位。

1.3.6 RNA提取、cDNA第一鏈合成及熒光定量PCR

1.3.6.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成

根據Tiangen植物多糖多酚總RNA試劑盒操作說明書，提取果肉中RNA。以提取的RNA為模板，利用Tiangen FastKing RT Kit反轉錄試劑盒操作說明合成cDNA。

1.3.6.2 熒光定量PCR(qRT-PCR)

基因PAL、C4H、4CL、CHI、FLS、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT、GST的引物參考CARMONA[10]等；內參基因(EF-1α)和CHS引物參考LO PIERO[20]等。qRT-PCR反應在96孔PCR板上加入如下反應體系：EvaGreen Express 2X，5 μL；Forward Primer，0.4 μL；Reverse Primer，0.4 μL；cDNA，1 μL；RNase-Free ddH2O，3.2 μL；總體積為10 μL。qRT-PCR反應使用BIO-RAD CFX96TMReal-Time Systerm儀器，其中反應程序是：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；58 ℃、30 s；經過40個反應循環。溶解曲線為：95 ℃、10 s，降溫至65 ℃之后再開始升溫，維持5 s采集熒光信號，到95 ℃結束反應。每個模板做3次重復，采用2-△△CT法計算基因相對表達量。

1.4 數據分析

采用Origin 2018軟件繪圖和SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析、LSD多重比較及Pearson相關系數分析。

2 結果與分析

2.1 血橙果汁中的色差變化

血橙色差變化由L*、a*、b*、CCI參數大小來表示(圖1)。L*值表示血橙果汁的亮度，整個貯藏期間，CK組在貯藏30 d急劇上升，顯著高于T1、T2組，而T1、T2組在貯藏15 d后顯著下降，趨于穩定狀態；a*值表示果汁的紅綠色差，在這里，a*值越大，表明紅色越深。T1和T2組a*值逐漸升高，而CK組呈現下降趨勢；b*值表示黃藍色差，這里則表明b*值越大，黃色越深，CK組升高趨勢顯著，突出CK組貯藏的果實的果汁顏色會傾向于黃色；CCI值表示綜合色差，CCI值越大，果汁紅色越深，T1和T2組逐漸升高，而CK組逐漸下降，可能由于在貯藏期間CK組中的亮度變亮，黃色占主要顏色，反之T1和T2組亮度變暗，紅色占主要顏色。其中，在貯藏后期，L*、a*、b*、CCI值在各處理溫度之間均出現顯著性差異(P<0.05)。

a-顏色變化；b-L*；c-a*；d-b*；e-CCI；CK-15～20 ℃；T1-6～8 ℃；T2-4～6 ℃；下同圖1 貯藏期間血橙顏色變化Fig.1 Color changes of blood orange during storage注：圖中的不同字母表示在P<0.05范圍內存在顯著性差異

2.2 血橙果肉中花色苷含量、總黃酮含量和總酚含量的變化

如圖2-a所示，T1、T2組，血橙中的花色苷呈現逐漸上升的趨勢。T2組，血橙果肉中花色苷從15.98 mg/L增加到28.36 mg/L。而CK組，血橙果肉中花色苷含量總體呈現下降趨勢，貯藏到60 d時，血橙中花色苷含量為11.07 mg/L，與T1和T2組存在顯著差異(P<0.05)。相較于CK組血橙中花色苷的積累，T1、T2組更有利于花色苷的積累。由此可見，花色苷生成對低溫有一定依賴性，這與前人研究結果一致[21-22]。

如圖2-b所示，總黃酮含量均增加。在整個貯藏中，CK、T1和T2之間不存在顯著差異性(P>0.05)。其中，T2組的總黃酮含量一直呈現逐漸上升狀態，貯藏至60 d時，達到最大值。如圖2-C所示，血橙總酚含量也有一定的增加。T2組，其含量從0.76 mg/g增加到1.05 mg/g-1。其中，在貯藏至15，45，60 d時，CK與T1、T2均出現顯著性差異(P<0.05)。

2.3 血橙果肉中酶活性變化

如圖3-a所示，在整個貯藏期間，CK、T1組，POD活性呈現先下降再升高再下降，且貯藏至30 d時，POD活性達到最大值，隨后CK組的酶活性出現大幅度下降。T2組，POD活性出現先下降再升高再降低再升高，且始終低于0 d時的酶活性。并且，在各個貯藏階段，各處理溫度之間均存在顯著差異(P<0.05)。其中，CK組的POD活性保持在較高水平，而在T2組處于較低狀態。

a-花色苷；b-總黃酮；c-總酚圖2 在貯藏期間花色苷含量、總黃酮含量、總酚含量的變化Fig.2 Changes of anthocyanin content、total flavonoids content and total phenols content during storage

圖3-b所示，CK組，PPO酶活性變化趨勢與POD活性一致，在貯藏到30 d時出現最大值，之后急劇下降；T1組，酶活性呈現先下降再升高再下降，并在貯藏后期的PPO活性高于CK和T2組；T2組，PPO活性出現先下降后略微上升趨于平穩，處于最低水平。

a-POD；b-PPO圖3 貯藏期間血橙中POD、PPO的變化Fig.3 Changes of POD and PPO in blood oranges during storage

2.4 血橙果肉中花色苷生成相關基因表達

血橙中的花色苷合成通路已經有較為成熟的闡述[10]。首先，由苯丙烷代謝途徑中的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、肉桂酸羥化酶(cinnamate hydroxylase，C4H)、香豆酞CoA連接酶(coriander CoA ligase，4CL)、查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構酶(chalcone isomerase，CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase，F3H)和類黃酮-3,5-羥化酶(flavonoid-3,5-hydroxylase，F3′5′H)的作用下發生一系列反應生成二氫黃酮醇。緊接著二氫黃酮醇可通過黃酮醇合成酶(flavonol synthase，FLS)作用下反應生成黃酮醇，還可由二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)、花青素合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和類黃酮3,5-糖苷轉移酶(flavonoid 3,5-glycoside transferase，UFGT)作用下生成穩定的花色苷，最后，花色苷在谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase，GST)作用下儲藏于液泡中。

如圖4所示，基因表達量T1、T2組均有增強。以二氫黃酮醇為分節點，即花色苷早期合成基因有PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H和F3′5′H；后期合成基因有DFR、ANS、UFGT和GST。從圖中看出，早期合成基因中無相對一致的變化規律性。花色苷的合成初始基因PAL在3組溫度中出現明顯差異，CK組PAL表達量幾乎為零，而T2組貯藏至15、30 d時，PAL表達量提高，達到0 d的10.5～11.0倍，并達到CK組的34.3～49.1倍。隨后，在貯藏到60 d時，PAL表達量達到CK組的76倍。同時，T2組，早期結構基因CHS和F3′5′H表達量一直呈現上升趨勢，在貯藏60 d時，與CK組相比，達到13.4倍(CHS)，9.92倍(F3′5′H)；與T1組相比，達到1.8倍(CHS)，1.3倍(F3′5′H)。其他早期合成基因C4H、4CL、CHS、CHI、F3H的表達量出現先升高后降低趨勢，但均高于CK組。而另一條途徑二氫黃酮醇通過黃酮醇合成酶(FLS)作用下反應生成黃酮醇中FLS的基因表達在各貯藏溫度中均出現下調，T1和T2組基因下調更為顯著。后期合成花色苷的基因DFR、ANS、UFGT和GST。T2組，貯藏至30 d時，達到了貯藏期間的較高值，與CK組相比，達到14.2倍(ANS)，5倍(UFGT)，16.2倍(GST)；貯藏到60 d時，相比CK組，達到16倍(DFR)，15.1倍(ANS)，8.1倍(UFGT)，28.4倍(GST)。盡管基因DFR、ANS、UFGT和GST在貯藏30 d達到較大值，但貯藏60 d時與CK組的比值更大，即隨著貯藏時間加長，花色苷合成速率減緩，在CK組血橙中花色苷合成途徑受到的影響更大。并且T1、T2組，DFR基因的高表達與FLS基因的低表達，從而誘導血橙中花色苷的生成。

a-PAL;b-C4H;d-SCL;e-CHI;f-F3H;g-F3′5′H;h-FLS;i-DFR;g-ANS;k-UFGT;l-GST圖4 血橙果肉中花色苷合成相關結構基因相對表達量的變化Fig.4 Changes in relative expression of anthocyanin-related structural genes in blood orange pulp

2.5 血橙貯藏過程中花色苷含量與結構基因的相關性

如表1所示，在整個貯藏期間，血橙中花色苷含量與結構基因PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT和GST呈正相關，與基因FLS呈現負相關，且結構基因之間也基本呈現顯著正相關；基因C4H與其他結構基因和花色苷未有顯著性。

3 討論

血橙因含有花色苷，酚類物質、維生素等營養物質，得到廣泛的關注。本文對血橙采后進行不同溫度貯藏，貯藏30 d直至60 d，4～6 ℃條件的CCI值與15～20 ℃呈現顯著差距，其血橙果汁紅色逐漸加深。相應的，在4～6 ℃條件下的花色苷含量從30 d開始出現線性增加。進一步發現，血橙中花色苷合成的主要基因PAL、CHS、DFR、ANS、UFGT和GST的表達量處于較高水平，并與花色苷含量呈顯著正相關。其中，C4H與花色苷含量之間存在較低的相關性，可能因為C4H屬于花色苷合成的前期基因，而低溫對花色苷合成的后期基因DFR、ANS、UFGT和GST有主要促進作用。則還可能是低溫啟動了血橙果實中Ruby轉錄因子表達，從而調控血橙中花色苷合成相關的后期結構基因表達顯著上調。BUTELLI等[23]研究中低溫啟動了血橙中Ruby轉錄因子的顯著表達，提高了花色苷合成的相關基因表達量，從而誘導血橙中花色苷積累。其他研究者也得出花色苷合成的結構基因受到相應轉錄因子的調控，進而影響結構基因的表達。KOBAYASHI等[24]報道了MYB基因調控UFGT基因表達上調，從而促進巨峰葡萄果實中花色苷積累。柑橘中R2R3-MYB轉錄因子基因CsMYBF1，該轉錄因子可激活CHS基因的啟動子，提高CHS基因的表達[25]。在菊花中，CmbHLH2和CmMYB6結合調控DFR基因表達上調而提高花色苷的含量[26]。因此，之后還可對血橙中花色苷合成相關的轉錄因子進行更深一步研究。

表1 皮爾遜相關系數Table 1 Pearson correlation coefficients

注：表中每列“**”表示P<0.01；“*”表示P<0.05

血橙中抗氧化活性成分除花色苷外，果實中富含的多酚、類黃酮也具有抗氧化活性。本文中4～6 ℃條件，血橙中的總酚、總黃酮含量高于15～20 ℃、6～8 ℃條件的果實，并在貯藏期逐漸上升。可能因為多酚、類黃酮均屬于苯丙烷途徑中的代謝產物，4～6 ℃條件提高PAL、CHS、4CL的基因表達量，促進了多酚及類黃酮的積累，從而增強了果實的抗氧化性。HABIBI等[27]研究發現了血橙中的花色苷和酚類物質可增強總抗氧化活性。這一結果與何禮等[28]一致，低溫誘導花色苷積累，花色苷含量與血橙果實的抗氧化性呈顯著正相關。說明在4～6 ℃條件下，血橙中的花色苷和總酚可提高果實的抗氧化能力。

POD和PPO活性高低與果實中酚類物質的氧化有關[29-30]。圖3所示，在4～6 ℃條件下貯藏血橙，POD和PPO活性均處于較低水平。由此可見，該溫度貯藏抑制了果實中POD和PPO活性，降低血橙果肉中酚類物質的氧化，而使血橙中酚類物質的含量高于15～20 ℃、6～8 ℃條件的果實。這一結論與王雅楠等[29]一致：水揚酸(salicylicacid，SA)處理李果實，推遲POD和PPO活性上升，降低酚類物質氧化，從而減輕了果實褐變程度。

本文中低溫誘導血橙果實合成花色苷結構基因的表達，從而促進花色苷積累。同時，還提高果實中總酚總黃酮含量，增強了果實的抗氧化性，從而保持血橙采后品質。其中，以4～6 ℃貯藏的血橙中花色苷含量、總酚總黃酮含量最高，所以4～6 ℃貯藏血橙最適宜。但本文對血橙果實抗氧化活性只在于初步研究，針對低溫下果實抗氧化活性變化規律還需進一步研究。