輔助生殖中外科取精術所獲精子的處理與選擇

孫超，高永超，李愛莉，王晶，丁旭，黃艷紅*

(1.空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710032；2.兵器工業衛生研究所藥理毒理學研究室，西安 710065)

1992年，卵胞漿內單精子注射技術(ICSI)獲得首例活產為男性不育患者帶來希望，使用附睪和睪丸的精子可以幫助男性不育患者擁有后代，是一場前所未有的技術革命。無精子癥，臨床上分為梗阻性無精子癥(OA，約占40%)和非梗阻性無精子癥(NOA，約占60%)[1]。OA多通過附睪穿刺，如顯微附睪精子抽吸術(MESA)或經皮附睪穿刺抽吸術(PESA)獲得精子，成功率為100%；NOA則多通過睪丸活檢，如睪丸切開活檢取精術(TESE)或顯微鏡下睪丸切開取精術(micro-TESE)獲得精子，成功率大約為50%[2]。一項關于外科取精手術的meta分析研究提出應選擇侵入性最小的取精方法[3]。根據無精子癥的病因和患者情況的不同，用睪丸精子進行ICSI，成功率有很大差異[4]。NOA的受精率和臨床妊娠率一般低于OA。針對NOA，輔助生殖技術(ART)實驗室面臨的挑戰是：如何有效地處理組織且選擇那些最有潛力使卵母細胞受精并發育成可用胚胎的精子。本文總結分析了目前外科常用的幾種選取活的不動精子的技術及未來發展方向。

一、選擇精子的常規方法

外科取精術中，切除的睪丸組織通常含有大量血紅細胞，會影響精子的觀察，尤其是不動精子的觀察。附睪穿刺取精可獲得大量精子，但也有少量的紅細胞和非生殖細胞的污染，故均應對精子進行洗滌，離心去除雜質及有害物質，將沉淀制成精子懸浮液，用于精子選擇。從睪丸標本中提取精子的常規方法仍然以機械劃碎法為主，雖然酶處理法有效但并未廣泛應用。目前，對C級精子實施選擇的幾種方法已經通過測試并應用到臨床實踐中。

1.機械接觸技術(MTT)：自ICSI問世以來，只有當不動精子可用于行ICSI時，才使用MTT法區分精子是否存活。該技術是用注射針接觸精子尾部，觀察不動精子尾部是否柔軟。若尾巴柔軟并可恢復至其原形態，則該精子為活精子；若尾巴僵硬且不能恢復至原形態，則認為該精子是死精。無論是新鮮精子還是冷凍精子的TESA-ICSI周期，應用MTT技術能有效地鑒別出睪丸中活的不動精子，且睪丸中活動精子與不動精子在受精率、妊娠率和出生率方面無顯著性差異[5]。MTT的優點是不使用化學物質且不改變精子的完整性，從而使得精子可隨時行ICSI。但該技術的缺點是準確度低，故需要胚胎學家具有一定的經驗。并且當精子數量極少時，檢測非常耗時。

2.低滲腫脹試驗(HOST)：低滲腫脹試驗最初應用于評估精子膜的功能完整性，之后發展為鑒別用于ICSI的不活動精子的死活。原理是在低滲條件下，由于水的滲入，具有正常細胞膜功能的活精子尾部會腫脹或卷曲。經過對3種不同的低滲溶液進行比較，改良出一種更簡便的低滲試驗，將改進的HOST用于選擇睪丸中活的不動精子并行ICSI，與非低滲對照組相比，HOST組的受精率(28.2% vs. 43.6%)和累計妊娠率(2.9% vs. 20.5%)均有所提高[6]。世界衛生組織認定HOST可替代精子染色活力試驗，但是假陽性和假陰性結果則降低了此試驗的準確性。張哲歡等[7]報道了1例使用HOST-ICSI技術幫助Kartagener綜合征伴男性不育的患者獲得正常男性后代的病例。

3.化學活性增強劑：一些ART中心會在取卵前1日進行外科取精手術，將取出的精子進行培養，使精子成熟從而獲得運動能力。在OA患者中，體外培養可改善精子運動能力[8]，但培養時間超過48 h似乎會導致精子老化，這是由于DNA碎片增多和染色體結構異常增多引起的[9]。Balaban等[10]在143例NOA患者的睪丸精子培養液中添加了重組促卵泡素，發現精子的運動能力得到了改善。

隨著化學增強劑的添加使用，精子培養的成效已有初步體現。例如己酮可可堿(PTF)，其可抑制磷酸二酯酶活性，從而提高細胞內環腺苷一磷酸(cAMP)的水平，而cAMP可以促進精子運動。Tademir等[11]第一個提出PTF對睪丸不動精子的運動能力具有改善作用。在附睪或睪丸精子懸浮液中添加PTF可以使活的不動精子發生運動，行ICSI后，配偶成功妊娠并得到健康嬰兒[12]。解凍的睪丸精子經PTF處理后，運動能力明顯提高[13]。Mangoli等[14]的一項研究指出，使用PTF選擇睪丸中活的不動精子比HOST的成功率更高，而且顯著縮短了鑒定和選擇精子的時間。陳智勤等[15]報道在睪丸不動精子樣品中加入PTF，可使不運動的活精子獲得接近或達到睪丸活動精子的平均運動能力，但其安全性還需進一步驗證。另有研究表明，黃嘌呤家族的另一成員——茶堿，可直接提高精子活力但時效較短[16]。茶堿在10 min內開始激活精子，最長可持續1 h，獲得運動能力的精子在注射前需放入精子緩沖液中清洗，去除化學試劑。將PTF或茶堿治療用于臨床，目前雖未見子代異常的報道，但仍需更多的隨訪研究以證明其安全性。

4.激光輔助不動精子選擇(LAISS)：Aktan等[17]利用激光鑒定活的但不能運動的精子，方法是將129 μJ的點激光打在精子尾部尖端約1.2 ms，活的但不能游動的精子尾部會發生蜷曲。若未觀察到精子卷尾，則表明該精子為死精。Nordhoff等[18]證實了使用激光輔助選擇睪丸不動精子后，受精率增加。陳煥華團隊多次報道了應用激光從新鮮或復蘇后完全不動精子中篩選存活精子行ICSI后成功妊娠[19-21]。激光的優點是不需要任何化合物誘導精子運動，但其熱能量是否對精子染色體造成傷害有待研究隨訪，且未見大樣本量的隨訪報道。

5.雙折射偏振顯微鏡(BPM)技術：這項技術最早由Baccetti等[22]提出，其原理是活精子的頭部結構使其可自然雙折射，而死精子因結構不同不能發生雙折射。應用偏振光顯微鏡可以觀察到精子頭部的雙折射，判斷精子的活力。在男性因素導致的不育癥患者中，選擇雙折射陽性的不動精子進行ICSI治療，臨床妊娠率(58% vs. 9%)和著床率(42% vs. 12%)均高于陰性對照組[23]。但是這些結論尚缺乏大樣本量研究，且BPM成像設備成本較高。

綜上，這幾種技術均可選擇活的不動精子，但每種技術都有其利弊。目前也沒有大樣本量的研究來評估這些技術的有效性。無論使用何種技術，用不動精子進行ICSI的成功率仍低于活動精子[24]。

二、發展動態

外科取精技術應用于ICSI已有20余年，OA患者可能受益于PESA、睪丸細針抽吸術(TFNA)或TESE，但通過傳統外科方式或使用手術顯微鏡進行多次開放切除取樣是治療NOA患者的最佳方式。胚胎學家面臨的挑戰是如何優化處理來自NOA患者的組織，找到更多的精子，并選擇活力和形態最好的精子進行注射。目前沒有文獻報道實驗室階段獲精率的影響因素，但這一階段可能比外科醫生的技術更為重要。現已有多種可成功選擇活的不動精子的方法，ART實驗室則會根據各自團隊的專業知識、經驗水平和設備成本等選擇最合適的取精方法。有縱向隨訪顯示，超過三分之二的NOA男性并沒有實現成為生父的愿望[25]。

1.臨床應用方向：人們可能會提出這樣一個問題，先進的技術能否在手術過程中更準確地確定患者精子發生的進程？胚胎學家運用自動化非侵入性精子檢測技術篩選精子，可在提高精子獲精率的同時減少尋找時間。盡管NOA患者的治療取得了進展，但受精率、可用胚胎率、著床率和分娩率仍遠低于射精患者；與有正常精子發生的OA患者相比，NOA男性睪丸精子具有DNA碎片較高、非整倍體率增高、精子發生缺陷等特點，目前這些特點在ICSI鏡下選擇精子注射過程中還無法識別[26]。拉曼顯微光譜學已用于人類活精子受損DNA的原位可視化研究中，但這項技術仍需進一步驗證[27]。

2.實驗室研究方向：對于沒有成功收集到精子的NOA患者而言，目前還沒有有效的治療方案，但是對動物模型的研究可能會給恢復男性生育能力帶來曙光，特別是診斷為精子成熟阻滯的患者，生殖細胞體外分化可能為其提供了一種新的治療方法。現在，有的團隊在研究小鼠的精子發生過程，有的團隊在培養小鼠睪丸組織，有的團隊在培養處理后的小鼠睪丸生殖細胞或精原干細胞[28]。目前正在建立各種模擬睪丸微環境的三維培養系統，例如人工支架，它模擬了曲精小管的空間環境，是研究體外精子發生的新方向[29-30]。雖然小鼠睪丸生殖細胞體外減數分裂已完成，并且完成精子體外發生后已成功受精，但將其應用到人類仍是一個具有挑戰性的課題，到目前為止，培養條件似乎并不適合人類精原干細胞的增殖[31]。

將胚胎干細胞或誘導多能干細胞在體外誘導生成精子是幾十年來的研究熱點。在小鼠中，已將胚胎干細胞和誘導多能干細胞誘導成具有全能精子生成能力的原始生殖細胞樣細胞，并成功生育后代，且正常發育至成年[32]。Vij等[33]綜述了NOA患者恢復男性生殖能力的3種實驗技術：精原干細胞移植、利用胚胎干細胞分化出成熟配子和基因治療。但目前這些技術還不能應用于人類，除了許多尚未解決的生物學問題外，安全問題和倫理問題亦不容忽視。

三、展望

通過外科手術取出精子進行ICSI已經在無精子癥患者的生育治療方面開辟了新領域，但NOA患者的精子獲精率和分娩率仍低于OA患者。從手術所獲組織中篩選精子的方法和選擇單個精子用于ICSI的方法取決于胚胎學家的習慣和實驗室設備。雖然有幾種技術已經可以最大限度地篩選出睪丸不動精子中可用的活精子，但也只有很少的NOA男性有機會獲得親生后代。改善NOA患者治療結局的研究仍在繼續。目前的研究主要集中在睪丸生殖細胞或精原干細胞體外減數分裂，以及體外誘導多能干細胞或體細胞形成精子。然而，許多生物學方面的問題仍未解決，在臨床應用前仍需要仔細研究安全性和倫理問題。