外源硫對鎘脅迫下馬齒莧光合性狀和礦質元素吸收的影響

王竹承 劉輝 李榮華

（1. 滄州師范學院生命科學學院，滄州 061001；2. 貴州省農業科學院生物技術研究所，貴陽 550006）

鎘（Cadmium，Cd）是一種能對人體造成巨大威脅的重金屬污染物。據統計，我國農業土壤的Cd污染位點超標率已達7%，Cd已成為我國土壤重金屬污染中的首要污染物［1］。Cd脅迫導致植物體內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量上升，破壞葉綠體結構、抑制碳固定酶活性，并通過影響蛋白酶活性而導致細胞代謝紊亂等［2-3］。另外，Cd脅迫抑制營養元素吸收而導致植株生長受限［4］。同時還能通過食物鏈危害人體健康［5］。因此，研究緩解或解除植物中Cd毒害的措施及其機理，是當前國內外研究的熱點問題。

硫（Sulfur，S）是植物體內胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等的組成成分，而這些含硫氨基酸參與幾乎所有蛋白質的合成，包括光合膜蛋白，因而對植物光合作用起著重要作用［6］。研究表明，半胱氨酸可通過其自身的抗氧化特性調節大麥氧化還原水平以緩解鹽脅迫誘導的生長抑制［7］。充分的硫肥可保證充足的還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）供應，以緩解因鹽脅迫誘導的氧化脅迫對植物光合效率和生長的影響［8］。同時，植物對S的吸收和同化可促進蛋白源和非蛋白源硫醇的合成，以及鐵膠膜（Iron plaque）的形成，從而提升植物對Cd的耐受性［9］。研究表明，添加外源S可以提升Cd脅迫下植物體內GSH的合成，降低ROS的積累，減少ROS對植物葉片基質蛋白和類囊體蛋白的攻擊，調節氣孔運動，從而增強植物的光合能力［6］；提升植物螯合素（Phytochelatins，PCs）、金屬耐受蛋白（Metallothioneins，MTs）的合成，并與Cd結合形成螯合物，降低Cd毒性［10-11］。因此，適量添加S肥對作物正常生長和緩解Cd毒過程具有重要意義。然而，當前對外源S是否影響與植物光合作用緊密相關的礦質元素的吸收，并揭示其與光合作用之間關聯性的研究相對缺乏。

馬齒莧（Portulaca oleraceaL.）是中國古老的菜藥兼用性肉質草本植物［12］。鑒于馬齒莧的高營養保健功效，已經馴化出栽培型馬齒莧品種，品質和口感均較野生型品種有所提高。但是，農業土壤Cd污染的加重，加之馬齒莧對Cd具有較高的吸附效應，導致馬齒莧的食用安全性大大降低［13］。因此，需要通過適當的措施，減少Cd向馬齒莧葉片中的轉移，提升其可食用性。當前對馬齒莧對Cd脅迫生理生化響應機制的研究較少，更缺乏外源添加物影響馬齒莧重金屬耐受性的相關研究。本課題組前期研究發現外源S可以通過增強馬齒莧體內乙烯信號傳導途徑，促進GSH的合成，而降低葡萄糖含量，從而緩解Cd脅迫誘導的氧化脅迫和葡萄糖介導的光合抑制作用，并降低馬齒莧對Cd的吸收。然而，關于外源S促進Cd脅迫下馬齒莧光合作用的內在機制仍未可知。

本研究以馬齒莧為試材，探討Cd脅迫下外源S對馬齒莧葉片光合作用、葉綠素熒光參數和礦質營養的影響，以揭示在添加外源S的情況下，馬齒莧礦質元素與光反應系統之間的關聯性，為揭示外源S緩解重金屬毒害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬齒莧種子購自江蘇長景種業有限公司（荷蘭進口）。將馬齒莧種子于35℃水浴浸種處理12 h，播于裝有沙子的育苗盒（15穴，穴上口3.0 cm ×3.0 cm，穴底徑3.0 cm×3.0 cm，穴深4 cm）中，置于人工氣候培養箱（LRH-800-GS，天津市福元銘儀器設備有限公司）中栽種。培養箱條件：14 h白天/10 h黑夜，晝夜溫度為30℃/25℃，相對濕度75%，光強設置為 500 μmol/（m2·s）。前期每天用自來水澆水一次，生長一周后改用1/2 Hoagland營養液的營養液（pH6.0）澆水，澆水量以使沙子充分濕潤為準。待馬齒莧幼苗長至10 cm左右時，選擇長勢良好和長勢一致的植株進行試驗處理。

前期試驗研究發現，馬齒莧最適Cd處理濃度和S處理濃度分別為100和400 mg/L。本研究設置3個處理：1/2 Hoagland營養液（CK）、1/2 Hoagland營養液+100 mg/L CdCl2（T1）和1/2 Hoagland營養液 +100 mg/L CdCl2+400 mg/L（NH4）2SO4培養液（T2）。為排除NH4

+的影響，在CK和T1組均添加相同濃度的NH4Cl。每個處理8盆，每盆種植15株。脅迫處理15 d后進行指標參數測定，每個指標測定生物學重復3次，取平均值。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量的測定 稱取植株中上部功能葉片0.5 g于4℃預冷的研缽中，加入5 mL 80%的預冷丙酮和少許MgCO3，于冰上避光條件下研磨至勻漿，轉入10 mL離心管中，殘渣用5 mL 80%的丙酮洗入離心管中。4 000 r/min 4℃離心后，上清液轉入25 mL容量瓶中。按上述方法對殘渣沉淀用80%丙酮進行重懸浮、離心，直至沉淀呈白色為止。定容后，采用722S型可見分光光度計（上海添時科學儀器有限公司）分別測定645和663 nm波長下葉綠素提取液的吸光值，采用以下公式計算葉綠素含量［14］：

1.2.2 光合參數測定 利用LI-6400XT便攜式光合測定儀（LI-COR公司，美國）測定不同處理下馬齒莧葉片的光合速率（Net photosynthesis rate，Pn）、蒸騰速率（Transpiration rate，Tr）、氣孔導度（Stomatal conductance，Gs）、胞間二氧化碳濃度（Intercellular CO2concentration，Ci），使用人工光源，光強為1 000 μmol/（m2·s）。

1.2.3 葉片熒光參數的測定 用配有熒光葉室的 LI-6400XT便攜式光合系統（LI-COR公司，美國）測定成熟葉片的凈光合和熒光-光強響應曲線及暗呼吸速率（Dark respiration rate，R）。設定如下參數：氣孔比率為0，參比室CO2濃度為400 μmol/mol，氣體流速300 μmol/s，干燥管全旁路，氣溫30℃。參照萬雪琴等［15］方法測定各處理條件下馬齒莧葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、恒態熒光（Fs）、能化類囊體最大熒光（F'm）、能化類囊體最小熒光（F'o）和氣體交換參數。具體操作如下：（1）將葉片放于葉室中，暗適應30 min后，記錄暗呼吸速率。然后在開啟熒光記錄（Fluorescence recording）的同時，于中心波長為630 nm處，測定Fo值。然后用中心波長為630 nm，光強為8 000 μmol/（m2·s）的飽和光測定Fm；（2）用強調為 1 000 μmol/（m2·s）的測定光持續照光20 min，測得Fs，然后用8 000 μmol/（m2·s）的飽和光（同上）測得F'm，最后在暗脈沖（即中心波長為740 nm的遠紅光，同時關閉LED光化學光）的作用下測得F'o。

用光強 ＜100 μmol/（m2·s）范圍內的光響應回歸直線方程求算光補償點（Light compensation point，LCP）、光飽和點（Light saturation point，LSP）、表觀量子效率（Apparent quantum efficiency，AQE）；用通過擬合各處理的光響應曲線求得的回歸方程，計算出凈光合速率達到最大光合速率90%處的光強作為光飽和點。其他光合參數計算如下：

其中，PFD表示光強，α是葉片對入射光的吸收比率常數，取值0.85。

1.2.4 Cd含量與礦質元素含量測定 收集脅迫處理后的馬齒莧葉片，稱取鮮重，110℃殺青1 h、70℃恒溫干燥、稱重。干樣用HNO3-HClO4（4∶1 V/V）消煮（160℃）至澄清，定容以后，利用AA370MC型原子吸收分光光度計測定各組織中的Ca、Mg、Fe、Cu和Mn等礦質元素含量［16］。

1.2.5 數據統計 所得數據以平均值±標準差（n=3）表示。采用SPSS18.0對試驗數據進行統計分析，各處理間數據采用方差分析（One way ANOVA），利用最小顯著差（Least significant difference，LSD）法檢驗差異顯著性（P≤0.05），采用excel 2007作圖。

2 結果

2.1 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片葉綠素含量的影響

由表1可知，與對照相比，100 mg/L Cd處理使馬齒莧葉片中的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量分別降低47.01%、41.30%和38.19%，葉綠素a/b比值則顯著降低22.90%。而添加外源S以后，與Cd處理（T1）相比，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量顯著上升，葉綠素a/b比值顯著增加，其中，葉綠素a含量幾乎恢復至對照水平（表1）。

表1 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片葉綠素含量的影響

2.2 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片光合參數的影響

由圖1看出，與對照相比，Cd處理15 d后，馬齒莧葉片的Pn、Tr和Gs分別降低196.18%、165.65%和74.57%，而Ci則顯著提升70.96%。與Cd 處理（T1）相比，外施 400 mg/L（NH4）2SO4處理（T2）導致馬齒莧葉片的Pn、Tr和Gs分別提升96.45%、79.94%和27.53%，Ci值則顯著降低30.92%。表明外源S可以緩解Cd脅迫對馬齒莧葉片光合作用的影響。

馬齒莧葉片的最大凈光合速率（Pnmax）、光飽和點（LSP）、表觀量子效率（AQE）和呼吸速率（R）在Cd處理以后，與對照相比，分別降低182.31%、134.07%、205.56%、107.14%，光補償點（LCP）則上升150.96%（表2）。與Cd處理（T1）相比，添加外源S可使Pnmax、LSP、AQE和R分別提升93.86%、96.06%、155.56%和59.52%，而LCP則降低47.38%。結果表明，外源S可顯著促進Cd脅迫下馬齒莧葉片的碳同化能力和新陳代謝速率。

圖1 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片凈光合速率Pn、蒸騰速率Tr、氣孔導度Gs和胞間CO2濃度Ci的影響

2.3 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片葉綠素熒光參數的影響

與對照（CK）相比，Cd處理（T1）可使馬齒莧在暗適應下的葉綠素最小熒光（Fo）顯著提升49.49%，而光適應下的kP/kN、最大熒光（Fm）、PSⅡ最大量子效率（Fv/Fm）、實際量子效率（ΦPSII）和電子傳遞速率（J）分別降低55.43%、42.36%、31.11%、45.83%和64.05%（表3）。另外，Cd處理導致非化學猝滅系數（qN）顯著提升45.28%，而化學猝滅系數（qP）則下降51.06%（表3）。在添加外源S以后，與Cd處理（T1）相比，Fo和qN分別降低19.49%和16.88%，而kP/kN、Fm、Fv/Fm、ΦPSⅡ和J則分別提升53.73%、58.97%、35.01%、56.52%、38.46%和107.75%（表3）。

2.4 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片中與光合系統相關礦質元素含量的影響

與CK相比，Cd處理（T1）可使馬齒莧葉片Ca、Fe含量分別提升25.52%和40.02%，而Mg、Mn、Cu含量則分別降低194.28%、96.88%和217.96%（表4）。與Cd處理（T1）相比，外施400mg/L（NH4）2SO4（T2）可使 Ca、Fe含量顯著提升23.13%和35.27%，同時可使Mg、Mn、Cu含量分別提升99.44%、40.49%和111.76%（表4）。結果表明，外源S可以顯著提升馬齒莧對礦質元素的吸收，從而增強其在Cd脅迫環境中的光合作用。

表2 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片光合作用的影響

表3 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片葉片PSII光化學效率參數的影響

表4 外源S對Cd脅迫下馬齒莧葉片礦質元素含量的影響

3 討論

植物受到重金屬脅迫時，典型癥狀就是抑制葉綠素的合成，導致葉色黃化，從而顯著抑制植物的光合作用。因此，葉綠素含量常作為判斷植物抗逆性能的重要指標［17］。本研究表明，Cd脅迫可顯著降低馬齒莧葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量，同時降低葉綠素a/b比值，而外源S則可使葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量以及葉綠素a/b比值上升，表明外源S可通過增強馬齒莧葉綠素的合成增強馬齒莧的抗Cd性。這與外源S可促進Cd脅迫下小白菜葉綠素合成的研究結果一致［18］。

通常情況下，逆境脅迫引起植物光合速率下降的主要原因可歸為兩類：一是受氣孔導度（Gs）影響的氣孔因素；二是受葉肉細胞光合活性影響的非氣孔因素［19-20］。Farquhar等［21］認為當Pn、Gs和Ci值在逆境中同時降低，則表明氣孔因素是抑制Pn的主要原因；若植物葉片Pn值下降，而Ci值卻上升，則表明光合作用的抑制是由非氣孔因素引起的。本研究顯示，Cd處理15 d后，馬齒莧葉片的Pn、Gs值顯著下降，而Ci值顯著上升，表明非氣孔因素是Cd脅迫誘導馬齒莧葉片光合效率下降的主要因素。外施S能顯著提升Cd脅迫下馬齒莧葉片Pn、Tr和Gs值，從而提升了馬齒莧葉肉細胞光合活性，提升光合速率。Khan等［22］和Masood等［23］均發現Cd脅迫下印度芥菜葉片Pn、Gs和Ci值均顯著降低；外源S可顯著提升Cd脅迫下印度芥菜葉片Pn、Tr和Gs值，促進光合作用，表明氣孔因素是Cd誘導印度芥菜光合抑制的主要原因，同時也說明不同植物響應Cd脅迫時所采用的機制不同。

葉綠體的主要作用是將吸收的光能通過光合電子傳遞、葉綠素熒光和熱耗散3種途徑進行消化，因而逆境脅迫中植物葉片熒光參數的變化可以反映光合作用的情況［24-25］。Fv/Fm和Fo的變化可作為鑒別植物抗逆性的重要指標，而qP和qN則分別表示PSII天線色素吸收的光能用于光合電子傳遞的光能和以熱能形式消耗的光能［26］。本研究發現，Cd處理可使馬齒莧葉片Fo和qN顯著增加，而kP/kN、Fm、Fv/Fm、ΦPSII、電子傳遞速率（J）和qP顯著下降（表 3）。添加外源S則可顯著降低Fo和qN值，而kP/kN、Fm、Fv/Fm、ΦPSII、J和qP則顯著上升（表3）。Fm隨被激發的葉綠素分子數量的增加而上升，因而Cd處理下馬齒莧葉片Fm的降低與葉綠素分子減少有關［15］，這與本研究中葉綠素a和葉綠素b含量降低的結果一致。Cd處理下Fo的上升和kP/kN的下降表明被葉綠素吸收的能量轉化成電能（電子傳遞）的比例下降，這與單位面積葉綠素分子數量減少，使光能在天線色素分子間的傳遞效率顯著降低有關，同時與PSII反應中心數量減少或遭破壞而導致捕獲天線色素分子傳來的能量效率降低緊密相關［15］。Cd脅迫下馬齒莧葉片qN的上升和qP的降低，表明天線色素分子所捕獲的光能主要以熱量而散失掉，從而導致ΦPSII和J的顯著降低，導致PSII反應中心的電子供體側的電子傳遞障礙。而添加外源S，則可提升qP值而降低qN值，增強天線色素分子對光能的捕獲和傳遞效率，從而促進馬齒莧葉片PSII光反應系統。

前人對Cd處理導致植物葉片黃化的原因總結為3類：一是認為Cd脅迫降低植物對Fe、Mg等礦質元素的吸收，直接抑制葉綠素的合成而失綠［27］；二是認為Cd脅迫抑制植物對Mn的吸收而間接抑制葉綠素的生物合成［28］；三是Cd脅迫破壞葉綠體結構破壞和合成受阻，間接導致失綠癥［29］。本研究發現Cd處理后馬齒莧葉片中Ca和Fe含量顯著上升，而Mg、Mn、Cu含量顯著降低，添加外源S則可使5種礦質元素含量均顯著上升，表明Cd處理導致的馬齒莧葉片失綠不是Fe、Ca虧缺引發的，而與Mg、Mn和Cu的缺乏有關。Mg是葉綠素分子的直接組成成分，參與誘導類囊體光合膜垛疊成基粒，對提高PSII的相對熒光產量、活性、原初光能轉化效率和葉綠體電子傳遞速率具有重要作用［30］；Mn是許多碳固定相關酶（如檸檬酸脫氫酶、草酰琥珀酸脫氫酶）的活化劑，Mn聚集體和3條多肽鏈構成的復合體帽結構是PSII氧化端最主要的結構單元-放氧復合體（OEC）的重要組成部分，Mn聚集體的破壞可抑制水的光解和電子傳遞［15，31-32］；Cu是是光合作用電子傳遞鏈中質藍素（Plastocyanin）的組成成分，銅的虧缺可導致光合電子傳遞活力下降［32］。因此，Cd處理后Mg、Mn、Cu含量的降低是導致馬齒莧葉片黃色癥狀、光合效能和光合電子傳遞下降的主要原因。Matraszek等［33-35］研究發現Cd脅迫誘導的小麥、白芥菜、萵筍葉片N、P、K、Ca、Mg等離子的降低，抑制植物生長，而外施S則可促進這些植物對營養元素的吸收。本試驗表明外源S顯著促進馬齒莧對Ca、Fe、Mg、Mn、Cu的吸收，推斷外源S提高葉綠素含量的原因可能是通過提高對Fe、Mg、Mn、Cu等的吸收和運輸，促進其向葉綠體的分配，從而增強馬齒莧葉片葉綠素的合成和葉綠體結構的完整性，維持馬齒莧穩定的光合速率和PSII光反應系統功能，以抵御Cd脅迫環境。

4 結論

從光合作用層面，外源S誘導馬齒莧Cd脅迫耐性的可能機理為：（1）增強馬齒莧葉片葉綠素a、葉綠素b的合成；（2）提升Cd脅迫下馬齒莧葉片Pn、Tr和Gs值，通過抑制非氣孔因素引起的馬齒莧葉肉細胞光合活性降低，提升光合速率；（3）提升qP值而降低qN值，提升天線色素分子對光能的捕獲和傳遞效率，增強馬齒莧葉片PSⅡ光反應系統；（4）促進馬齒莧對Ca、Fe、Mg、Mn、Cu的吸收，促進葉綠素的合成、葉綠體和放氧復合體結構穩定性和質藍素的合成，提高PSII的相對熒光產量、活性和原初光能轉化效率，以及水的光解和PSⅡ電子傳遞速率，從而增強光合作用。