基于CRISPR-Cas13家族的RNA編輯系統及其最新進展

陳敏潔 唐桂月 洪香娜 郝沛 江靜 李軒

（1. 中國科學院分子植物科學卓越中心合成生物學重點實驗室，上海 200032；2. 中國科學院上海巴斯德研究所病原發現與大數據中心，上海 200000；3. 河南大學生命科學學院棉花生物學國家重點實驗室植物逆境生物學重點實驗室，開封 475004）

RNA作為一種重要的生物大分子，參與細胞生命代謝的整個過程，其代謝異常會導致多種疾病的發生［1］。故了解RNA的功能和代謝對于人類健康至關重要。目前，靶向DNA的技術如鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）、CRISPR-Cas9 或 Cas12 等［2］現已成為生物醫學實驗室的常規操作，并且已經初步應用于臨床醫學領域。然而DNA序列一旦干預成功，在很大程度上會遺傳給后代，具有永久性與不可恢復性。與相對穩定遺傳的DNA不同，RNA引起的改變是暫時、非永久性的。但是RNA生物學的極度復雜性導致很難精確地靶向、跟蹤或編輯。目前靶向RNA的技術主要包括RNAi、MS2技術、ADARs技術及CRISPR-Cas13 技術等［3］。

本文主要對目前最新的靶向RNA技術的CRISPR-Cas13家族的分類及防御機制進行綜述，介紹了 CRISPR-Cas13 技術的應用以及基于CRISPRCas13家族的RNA編輯系統的最新研究進展，并對目前CRISPR-Cas13 RNA編輯技術體系存在的問題進行分析和對未來的發展進行展望。

1 CRISPR-Cas13家族和分類

CRISPR-Cas13是基于細菌免疫系統的RNA靶向和編輯系統，可保護其免受病毒侵襲。該系統類似于CRISPR-Cas9系統，但與靶向DNA的Cas9不同，Cas13蛋白僅靶向切割單鏈RNA。CRISPRCas13（以前稱為 C2c2）［4］是 CRISPR-Cas系統中的第二大類第VI型，是家族中目前發現的唯一只靶向ssRNA的系統。它包含單一的效應蛋白質Cas13，與 CRISPR RNA（crRNA）組裝時形成一個由crRNA引導的RNA靶向效應復合物。迄今為止研究的所有Cas13蛋白都具有兩種不同的核糖核酸酶活性［5］，一種是RNase負責pre-crRNA的預處理形成成熟的VI型干擾復合物［6］；而另一種RNase 活性由兩個較高等真核生物和原核生物核苷酸結合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）結構域提供，是target-RNA 在病毒干擾過程中降解所必需的，研究證明這兩個HEPN結構域中的單點突變會完全消除 RNA 的切割［4，7-8］。HEPN 結構域能夠幫助切割 ssRNA，但不能切割 dsRNA、ssDNA或 dsDNA，且當RNA 靶中存在折疊結構時，Cas13優先在非堿基配對的 ssRNA 區域進行剪切［9］。

圖1 CRISPR-Cas13家族分類圖

目前CRISPR-Cas13根據系統發育可分為4個亞型（A、B1、B2、C 和 D）［6，10］（圖 1）。同源序列分析表明Cas13四個亞型具有低同源性，且同源序列僅限于HEPN結構域位點。HEPN結構域可以存在于Cas13不同位置，在VI-B型基因座中還存在其它特征，VI-B1系統具有額外的ORF，CSX28，其編碼具有一個跨膜結構域（或可能是信號肽）和一個HEPN結構域的小蛋白質。然而，VI-B2系統在許多情況下（但并非所有）存在不同的ORF，Csx 27，也編碼一個小蛋白質，似乎包含3-4個預測的跨膜結構域，從而進一步被劃分為B1和B2亞型［11］。最新發現的亞型VI-D和相關的效應蛋白 Cas13d，它們主要存在于Eubacterium和Ruminococcus兩種細菌中［6，11］。VI-D亞型比以前發現的所有亞型都小得多（比先前鑒定的Cas13蛋白小約26%）［6］。此外，與VI-B系統一樣，絕大多數VI-D系統都含有相關的輔助蛋白，這些蛋白質都含有WYL結構域，這個結構域通常與原核防御系統有關［12］。除了系統發育特征外，亞型之間的功能也存在差異。例如，Seletsky等［13］對11個Cas13a 同系物的pre-crRNA 處理行為進行的研究。

2 CRISPR-Cas13家族防御的分子機制

CRISPR-Cas13系統的防御過程與其他CRISPRCas系統相似，包括 3 個階段：第一是新間隔序列的獲取［14］，稱適應階段；第二是 crRNA的合成［15］，即 CRISPR基因座的表達；第三是對外來核酸的抵御，稱干擾階段［16］（圖2）。適應階段獲取外源核酸序列整合在CRISPR陣列中。CRISPR陣列包括交替的半回文直接重復序列和由整合酶Cas蛋白插入的外源核酸“間隔”序列組成。一直以來Cas1、Cas2被認為是參與新間隔獲取的主要功能蛋白［17］，然而在一些情況下，VI型CRISPR-Cas缺乏適應基因（Cas1、Cas2）［11］，表明它們可能利用同一基因組中其他 CRISPR-Cas基因座的適應模塊，或者失去了它們的適應模塊，不再積極地獲得新的間隔［18］。

圖2 CRISPR-Cas13家族分子防御過程

CRISPR基因座表達起始產物pre-crRNA，經過相關Cas 蛋白和RNA 核酸酶的加工形成成熟crRNA，此過程即為 CRISPR 基因座的表達［13，19］。研究表明，VI型crRNA處理是由Cas13中的一種專用RNA核酸酶進行的。East-Seletsky等［5］首先證明Cas13a具有pre-crRNA加工活性，并且該活性不需要HEPN核酸酶結構域。Cas13b和Cas13d也被證明具有pre-crRNA處理活性，在Cas13b的系統中，pre-crRNA被加工成一個66 nt的成熟crRNA（一個30 nt的5' -間隔和一個36 nt的3'-直接重復序列）［11］。而Cas13d pre-RNA加工產生的成熟crRNA具有與Cas13a家族相似的重復間隔結構［6］。鑒于在 VI-A、B和D型系統中pre-crRNA處理的保守性，Cas13c也很可能保持切割pre-crRNA的能力，但還需要進一步研究證實。

成熟的crRNA能夠招募Cas13蛋白，從而完成防御入侵最重要的一步干擾階段，準確識別外源核酸并對其進行精準剪切。CRISPR-Cas13的4個亞型中，形成的crRNA結構存在一定的差別。在Cas13a：crRNA復合物中，直接重復序列形成5-6個Watson-Crick堿基對的莖，由保守的2nt凸起（AC或AA）破壞，依賴于Cas13a一個7-9nt的莖環區域［9］。雖然目前還沒有高分辨率的VI-B型crRNA結構，但RNA二級結構分析表明，與VI-A、VI-C和VI-D crRNA相比，VI-B crRNAs具有更長的直接重復序列莖（總共9-14 bp），通常具有幾個不成對的區域和凸起，因此莖環更小［20］。除莖環結構之外，在 VI-B 型系統中，直接重復序列相對于間隔的順序也不同，直接重復序列的莖環位于間隔的3'處，而在VI-A、VI-C和VI-D系統中觀察到的直接重復序列在間隔的5'處結構不同。與VI-A型和VI-B型crRNA 相比，VI-C型crRNAs直接重復序列的長度較短（～30 nt）［21］，表明它在存在不同的適應模塊時可能與VI-A、B和D系統共同進化。最后VI-D型，包含具有36 nt 直接重復序列的crRNA，形成了一個保守的8-10 nt莖，帶有一個4-6 nt的環，一個5-10 nt的5'側翼單鏈區（在pre-crRNA中）和一個包含保守的末端AAAAC基序的5-7 nt的3'側翼單鏈區［6，12］。

Cas13：crRNA核酸靶向復合物與靶標核酸序列堿基互補幫助完成搜索過程和初始雜交。除此之外，如Cas9干擾復合物需要檢測dsDNA靶位點側翼的原間隔子相鄰基序（PAM）序列的存在也會幫助識別靶標序列［22-23］。然而，Abudayyeh等［4］探索了Cas13a對于在每個crRNA靶位點側翼的核苷酸是否表現出相同的序列偏好。他們發現對于LshCas13a，protospacer-3'側翼的第一個核苷酸表現出對A、U或C（H）而不是G的偏好性。通過體外RNA降解實驗證實了該結果，結果表明該位置存在G核苷酸會顯著降低HEPN核酸酶的活性，而A、U和C會導致最大活性［24］。為了避免與PAM在“自我”CRISPR基因組學中所定義混淆，作者決定將這一序列偏好稱為“Protospacer flanking site”（PFS），而不是“Protospacer adjacent motif”（PAM）。自從首次報道PFS 偏好LshCas13a 以來，PFS 偏好也被證實存在于其他幾種 Cas13酶中。使用體外裂解試驗，最初證明LwaCas13a具有輕微的“ H” PFS偏好［25］。此作者后來又證明，當對細菌篩選［26］或人類細胞系質粒文庫篩選［20］PFS時，LwaCas13a不會表現出任何可檢測到的PFS偏好，并且靶向人細胞中含ssRNA的G-PFS不會導致任何缺陷定位效率。

Cas13b酶的PFS要求也有所不同。在細菌中對于來自Bergeyella zoohelcum和Prevotella buccae菌的兩個不同的Cas13b靶標文庫篩選時，D（A、U或G）5'PFS和NAN或NNA 3'PFS是實現最佳RNA靶向所必需的［11］。相反，當對來自PspCas13b進行細菌中錯配的目標文庫實驗時發現，有效的靶標RNA裂解不需要優選的PFS［20］。與Cas13a或Cas13b相反，對于迄今為止研究的任何Cas13d直系同源物，使用細菌篩選策略均未檢測到PFS序列。目前，關于Cas13c酶家族是否存在PFS偏好尚無定論。

3 CRISPR-Cas13分子技術的應用

目前利用CRISPR-Cas13系統可對RNA進行編輯、敲除、檢測、追蹤及成像等［3］。Cas13a是第一個被用于靶向RNA切割的效應蛋白。Abudayyeh等［4］通過異源表達的Cas13a可以保護大腸桿菌免受MS2噬菌體的侵入，并首次在大腸桿菌中實現RNA敲除。作者通過改用Leptotrichia wadei（Lwa）來源的Cas13a實現了在哺乳動物細胞中進行RNA敲除［26］。基于Cas13a的RNA敲除系統與傳統的RNAi技術相比，RNA敲除能力相當但Cas13a脫靶率低且可以靶向細胞核內RNA。Cas13a的RNA敲除技術目前已經被應用到許多領域，如植物病毒敲除—蕪菁花葉病毒（TuMV，一種RNA病毒）［27-28］，馬鈴薯Y病毒（PVY）等［29］；哺乳動物細胞的單鏈RNA病毒敲除—淋巴細胞性腦膜炎病毒（LCMV），甲型流感病毒（IAV），水泡性口炎病毒（VSV）等［30］，癌癥相關的突變基因敲除，如KRAS等［31］。Cas13a被激活后附帶的非特異性RNA酶切活性目前還被應用于核酸快速檢測，如 Gootenberg等［25，32-34］開發的一種 “SHERLOCK”檢測系統可以在短時間內實現從患者體液樣品中進行無儀器的病毒的檢測。此外，Abudayyeh等［26］將生物素與dLwaCas13a融合的用于RNA免疫沉淀，通過將dLwaCas13a與負反饋（NF）系統結合使用，還可用于RNA成像的dLwaCas13a-NF系統。

Cas13d作為目前已知最短的Cas13蛋白，使其成為進一步開發靶向RNA 工具的潛在平臺［6，12，35］。Yan 等［12］與 Konermann 等［6］將不同的 Cas13d 與不同的融合標簽組合，實現在人細胞中的RNA敲除。此外，Cas13d目前還被應用于活細胞RNA成像［36］。Cas13d平均大小為930 aa，是哺乳動物細胞中表征的最小的2類CRISPR效應子，這使得Cas13d結構域可以與編碼多個gRNA的CRISPR陣列配對。同時，Cas13d基因組長度符合慢病毒遞送載體的包裝尺寸，Cas13d-慢病毒載體將成為原代細胞和體內遞送的有力工具。

4 基于CRISPR-Cas13的RNA堿基精確編輯系統

4.1 基于CRISPR-Cas13的RNA堿基A＞I精準編輯系統

靶向RNA編輯作為最新的研究方法，其不可永久性遺傳為治療某些遺傳性疾病提供一種更安全，更有效的替代方法。Cox等［20］將VI型CRISPRCas系統中無催化活性的dPspCas13b與ADAR2融合 的 REPAIR（RNA Editing for Programmable A-to-I Replacement）RNA堿基編輯系統在哺乳動物細胞中成功編輯與疾病相關的基因。REPAIR系統利用dcas13b指導ADAR2定點編輯最重要的兩個部分：具有催化活性增強的突變體ADAR2dd；特異性識別目標A·C錯配堿基。ADAR2是一種廣泛存在于哺乳動物之中的腺苷脫氨酶，可對特異性的雙鏈RNA進行A（腺苷）＞I（肌苷）脫氨，肌苷被當成鳥嘌呤，并與胞嘧啶配對，從而實現堿基A＞G的轉變［37-38］。REPAIR系統目前主要分為兩個版本。REPAIRv1系統對靶序列具有較好的兼容性，在靶向熒光素Gluc RNA時，對靶目標16種可能的基序都檢測到編輯。REPAIRv1系統靶向Gluc的編輯效率可達89%，具有較高的編輯效率，但在靶向內源基因PPIB編輯率只有28%。為此作者在Cas13b與ADAR2之間加上一個多肽，結果REPAIRv1系統編輯效率提高，說明Cas13與ADAR2之間的連接多肽在改善系統編輯率中起到一定的作用。REPAIRv1系統相比于其他傳統RNA編輯技術—以ADAR2原始底物的編輯系統（如 BoxB- ADAR2［39］、全長 ADAR2［40］）編輯率高，但最近報導的以ADAR2原始底物的最新編輯系統的編輯率與REPAIRv1相當［41］。相比脫靶率，轉錄組測序顯示REPAIRv1的脫靶編輯率與BoxB-ADAR相當，但大于全長ADAR2的脫靶率，且脫靶位點主要集中在ADAR2原始底物結構基序部分。REPAIRv1脫靶效應主要是由于ADAR2的底物偏好性以及ADAR2dd的過度表達而引起。為了提高REPAIR的特異性，Cox等［20］通過在ADAR2上引入新突變（ADAR2 DD -E488Q-T375G）形成REPAIRv2系統，該系統在靶向Gluc其脫靶率低于REPAIRv1系統的約900倍，但編輯率也隨之降低（表1）。

表1 基于CRISPR-Cas13的RNA編輯系統編輯率與脫靶率

此外，本課題組利用無活性的dCas13a與ADAR2融合實現在酵母中的定點編輯［42］（圖3）。利用結合特異序列單鏈RNA能力的Cas13a，首次在模式生物裂殖酵母（S. pombe）中實現了靶向內源RNA和降解靶標RNA的功能。進一步，再利用喪失RNA切割活性的突變dCas13a與人源的RNA腺嘌呤脫氨酶催化結構域（hADAR2d）融合，引入到裂殖酵母中；再通過設計指導RNA，實現了對內源RNA的精確定點編輯。對RNA定點編輯系統的參數（編輯堿基位置、距離、指導RNA結構和長度等）進行優化，優化后的編輯系統對內源靶標RNA的編輯效率達到了59%。

圖3 dCas13a與dCas13b介導的RNA堿基編輯系統的比較［42］

4.2 基于CRISPR-Cas13的RNA堿基C＞U精準編輯系統

Abudayyeh等［43］最近發表的一篇關于對RNA實現胞苷（C）＞尿苷（U）的精確編輯系統RESCUE（RNA Editing for Specific C-to-U Exchange），擴展RNA編輯的功能，擴大了可解決的疾病突變和蛋白質修飾的范圍。

RESCUE系統利用無催化活性的靶向RNA的CRISPR-Cas13b（dCas13b）與改造后具有 C＞U 的ADAR2的腺嘌呤脫氨酶域融合而成。ADAR2具有天然A＞I脫氨活性，作者根據ADAR2與底物結合的結構初步突變了與底物結合的3個關鍵位點（V351G、S486A、T375S）使其具有C＞U的脫氨作用，并在酵母中靶向外源基因Gluc具有15%的編輯率，作者在此基礎之上又經過16輪突變篩選獲得具有較高編輯效率的RESCUE16系統。RESCUE系統在靶向16種Gluc的靶基序均具有編輯，并且gRNA spacer具有C或U錯配時具有較高的編輯率。RESCUE在靶向HEK293細胞內源基因時，編輯最高能達到42%左右，其偏好性主要集中在5' U或A且受U或者 A 錯配位置影響。此外，作者還在體外證明了該系統對DNA、sRNA沒有胞苷脫氨作用。為了證明該系統可應用于治療作用，作者利用RESCUE系統調節STAT和WNT-β-catenin信號通路。將具有RESCUE質粒和gRNA質粒轉染HEK293FT細胞和人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），通過靶向 β-catenin上CTNNB1的已知磷酸化殘基，其編輯率最高可達28%，而被激活WNT-β-catenin信號傳導最高可以提高到5倍。

改造后的ADAR2仍具有A＞I的活性，Cas13b能夠將pre-crRNA加工形成A＞I/C＞I的gRNA同時實現A＞I和C＞U的編輯。作者通過優化gRNA，可同時靶向HEK293FT細胞中CTNNB1A＞I和C＞U的編輯。RESCUE在靶向Gluc引起A＞I脫靶位點有1695個，C＞U脫靶位點具有188個。為此作者又通過引進新的突變體，并發現S375A、S375C、S375N、N473I的引起脫靶率大幅度下降，其中S375A A＞I脫靶率降到139，C＞U 脫靶率降到103且編輯率沒有太大影響。

RNA編輯的一個主要優點是它的可逆性，相比之下，DNA水平上的變化是永久性的。RESCUE能夠被gRNA引導至目標RNA，實現C＞U編輯。該系統不僅擴大了RNA編輯系統的范圍，并為RNA編輯技術的潛在臨床應用奠定了基礎［44］，同時利用RESCUE擴展靶向能力意味著編輯新靶標的到來，通過磷酸化、甲基化和糖基化等蛋白翻譯后修飾可以調節蛋白的活性和功能的位點如今都可作為編輯的新靶標。但RESCUE仍具有較高的A＞I的RNA編輯活性，改造編輯酶或優化其他參數系統減少脫靶率仍是目前需解決的問題。

5 展望

RNA是細胞中最重要的信使分子之一。RNA的功能和動態代謝的表征對于理解生命過程至關重要。然而RNA是快速合成、代謝使得在體內很難靶向，跟蹤或編輯，CRISPR-Cas13系統為該領域提供了新的思路。基于Cas13蛋白開發的RNA工具在疾病研究和臨床治療中的應用將為人類醫療保健的巨大進步作出貢獻。

截至目前，人類致病突變最多的一類是點突變（也稱為單核苷酸多態性）［47］。基于CRISPR的靶向DNA 的堿基編輯系統—CBEs（C＞U）、ABEs（A＞U）基本上能夠實現4種堿基突變（C ＞T、A ＞ G、T＞C、G＞A）的修復，但靶向DNA具有可遺傳性和不可修復性等風險。相反，RNA編輯系統可以從RNA水平上進行修復而不會永久性地遺傳（表2）。目前基于CRISPR-Cas13家族的編輯系統A＞I（REPAIRv1）以及C＞U（RESCUE）基本上能修復致病突變的點突變。通過合理的設計方法，如gRNA的優化以及編輯蛋白的定向進化，可以進一步提高系統的特異性和效率。盡管目前基于RNA堿基編輯系統的例子非常令人鼓舞，但是將大蛋白遞送到特定組織、體內脫靶點突變的潛在生物學后果等相關工作依然具有挑戰性。因此，新型RNA堿基編輯器傳送系統的開發，包括針對特定組織的系統，可能是未來幾年的主要重點工作。