哺乳動物手工克隆的研究進展

韓梅 袁超 郭婷婷 吳怡 岳耀敬 楊博輝

（1. 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2. 中國農業科學院羊育種工程技術研究中心，蘭州 730050）

自從美國科學家 Briggs和 King［1］于 1952 年第一次通過囊胚細胞核移植成功獲得了克隆蝌蚪以來，科研人員開始了核移植的不斷探索。英國科學家Wilmut等［2］在1997年使用綿羊乳腺上皮細胞作為核供體細胞將細胞核移入卵母細胞中，成功獲得世界上第一只克隆綿羊“Dolly”。Dolly的出生證明了高度分化的成年哺乳動物體細胞核在去核卵母細胞胞質中可以發生重新編程恢復其全能性，并且重組細胞能夠發育成與供體細胞遺傳物質相同的新個體，為體細胞核移植的研究奠定了的夯實的理論基礎。在此之后科學家利用傳統克隆技術先后成功克隆出牛［3］、山羊［4］、豬［5］等多種哺乳動物。然而克隆效率卻一直較低，并且該過程需要使用顯微操作儀去除卵母細胞核，然后通過融合法［6］或注射法［7］使供體細胞或供體細胞核進入去核卵母細胞，成本較高，操作復雜，且囊胚率較低。為此，科研人員不斷對TC進行改進。Vajta等［8］于2001年對Peura的方法進行改進，首次以體細胞為核供體細胞，通過手工操作將去透明帶核移植技術成功應用于克隆牛。這一改進的核移植技術便是手工克隆（Handmade cloning，HMC）技術。該技術不需要顯微操作儀、操作較簡單、成本較低，且克隆囊胚率高于基于顯微操作的TC［9-10］。表1總結了HMC和TC之間的異同。從HMC技術的出現直到現在，HMC技術已經用于多種動物的克隆，但是克隆效率仍較低。許多科研人員不斷對體細胞或重構胚進行不同試劑的處理，嘗試通過多種優化方法提高手工克隆效率。本綜述介紹了手工克隆技術的發展、操作研究以及影響手工克隆效率的因素。此外，除了HMC的優勢和局限性之外，本文還討論了該技術的未來前景，以期能夠提高牛、羊和豬等多種哺乳動物手工克隆的效率。PVA）、聚乙烯吡咯烷（Polyvinylpyrrolidone，PVP）和胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），并對綿羊卵母細胞的數量及重構胚的卵裂率進行了比較，實驗表明PVA和PVP可以作為血清替代品用于卵母細胞的體外成熟。Zhang等［20］使用HMC生產了肌醇六磷酸酶轉基因豬胚泡，為進一步生產植酸酶轉基因豬提供了基礎。也有研究表明，用HMC生產的成纖維細胞在歐洲可以有效地降低脫發性的能力［21］。Moulavi等［22］于2019年將最初用于綿羊的改良的手工克隆（Modified method of handmade cloning，m-HMC）技術應用于單峰駱駝的克隆，實驗結果表明m-HMC技術可能是一種有效生產克隆駱駝和使其商業化的可行的方法。Khan等［10］將通過TC和HMC兩種方法獲得克隆綿羊囊胚進行比較，結果HMC相比TC獲得的胚泡百分率更高。

1 動物手工克隆技術發展

1995年，Tatham等［11］通過用蛋白酶去除透明帶改進核移植程序，但未能成功產下小牛。隨后，Peura等［12］于1998年首次通過無透明帶的去核方法成功克隆了牛。Vajta等［13］于2004年在沒有顯微操作儀和CO2培養箱的野外進行實驗，采用HMC技術完成核移植，成功獲得非洲第一頭手工克隆牛。Lagutina等［14］于2005年用去透明帶法使馬卵母細胞獲得較高的融合率，并成功產下一只健康的活馬駒。隨后克隆出小鼠［15］、豬［16］、綿羊［17］等多種哺乳動物。此后，科研人員對HMC進行不斷研究，以期進一步優化手工克隆技術。尤其近幾年研究較多（表2），呂玲燕等［18］于2016年通過實驗表明丙戊酸（Valproic acid，VPA）處理可提高豬HMC重構胚胎的囊胚率。Quan等［19］于2017年在綿羊卵母細胞成熟培養基中添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，

表1 HMC和TC之間的異同

2 手工克隆技術操作研究

2.1 核供體細胞的準備

核供體細胞的來源和細胞周期的同步化是影響核供體細胞的重要因素。HMC最初利用牛胚胎細胞作為供體核的來源［36］。隨后科研人員又研究了許多其他來源，如囊胚細胞［37］、顆粒細胞［8］、胚胎干細胞［38］、牛［39］、山羊［36］、綿羊［40］成年成纖維細胞、豬［41］、山羊［42］胎兒成纖維細胞。供體細胞的選擇對于克服與核重新編程相關的問題非常重要。Saini等［36］研究表明成纖維細胞來源的供體細胞比上皮來源的供體細胞更容易發生重編程。近幾年通過對成纖維細胞的研究，Jena等［43］發現胎兒成纖維細胞和成年成纖維細胞對山羊HMC胚胎產生效率無顯著差異。Liu等［44］表明成年供體成纖維細胞的HMC胚泡形成率較高，而胎兒供體成纖維細胞的HMC發育異常率較低，且仔豬出生效率較高。并且Liu［45］等于2018年通過使用胎兒成纖維細胞進行體細胞核移植成功克隆了獼猴。另外，受體與供體核細胞周期之間的同步被認為是增加核重編程能力并提高克隆效率所需的關鍵因素［46］。經處理后處于G0/G1階段的供體細胞核移植胚胎胚泡發生率更高［47］。

2.2 受體卵母細胞的選擇，體外成熟和去核

卵母細胞的質量是在體外條件下胚胎成功發育的主要因素。形態學觀察是卵母細胞選擇的一種常見的做法，通過觀察卵母細胞周圍卵丘細胞層的數目，緊密度和卵質均一性進行選擇［48］。收集的卵母細胞基于觀察法可被分為3類：A、B和C級，研究表明A級卵母細胞成熟率更高并應用于體外胚胎生產［49］。也可以通過亮甲酚藍染色劑（Brilliant cresyl blue，BCB）染色進行選擇。Mohapatra等［50］使用BCB染色卵母細胞用于水牛HMC胚胎生產。根據MII中期階段是哺乳動物體細胞克隆產生胚胎的最佳時期這一特性［51］，卵母細胞在含有FSH、LH和雌二醇等激素的成熟培養基中體外成熟22 h-24 h［43］。成熟的卵母細胞可以通過鏈霉蛋白酶處理［13］或透明質酸酶處理［52］來去除透明帶。HMC中的去核方法主要包括化學輔助手工去核（Chemically assisted handmade enucleation，CAHE）和極體定向手工去核（Oriented handmade enucleation，OHE）。Li等［53］表明與OHE方法相比，CAHE后的體外發育能力較低。然而，Akshey等［54］研究表明CAHE獲得的胞質數明顯高于OHE，CAHE是一種用于山羊HMC的高效、可靠的去核方法。

表2 哺乳動物手工克隆技術發展事件

2.3 融合和胚胎培養

去核的卵母細胞與供體細胞的融合激活主要通過電激活和化學激活。Vajta等［8］通過電脈沖進行HMC胚胎的激活，Borah等［49］用鈣離子載體和6-（二氨基）嘌呤（6-dimethylamino purine，6-DMAP）處理進行化學激活。Akshey等［55］研究表明，電脈沖激活對山羊HMC胚胎卵裂率和囊胚率優于鈣離子載體激活。科研人員對融合參數進行了優化，如對于水牛HMC，Selokra等［56］已經優化了電融合條件，使融合率超過95%，胚泡率達到52.0%。融合后，胚胎培養體系和培養基的選擇對胚胎發育至關重要。融合后的胚胎培養體系包括微穴法（Well of the well，WOW）［57］，微滴法（Microdrop，MD）［58］和平面培養法（the flat surface culture system，FS）［59］，目前WOW和FS使用較多。培養基不僅為胚胎的體外發育提供營養，而且還會影響胚胎體內的發育。培養基主要包括（Modified charles rosenkrans 2，mCR2），改良的合成輸卵管液（Modified synthetic oviductal fluid，mSOF） 和（Research vitro cleave，RVCL）。Shah［59］等比較了 mCR2，mSOF 和 RVCL 三種培養基，發現在RVCL培養基中觀察到的水牛HMC卵裂率和囊胚率高于其他兩種培養基。另外培養基的選擇也取決于胚胎的發育階段，培養體系，胚胎類型和物種。mSOF培養基已經被廣泛用于MD的水牛HMC中［60-61］，而RVCL培養基最適合用于使用FS的手工克隆中［62-63］。

3 限制手工克隆效率的主要因素

影響HMC效率的因素眾多，包括體細胞的選擇，卵母細胞的選擇，卵母細胞的去核程序，重構胚的培養條件，重構胚的融合-激活方案和表觀遺傳重編程等。影響HMC效率的主要因素為異常的表觀遺傳重編程。Kang等［64］表明造成體細胞克隆效率低以及克隆動物各類異常表型的主要原因之一是表觀遺傳修飾在克隆胚胎早期發育階段的異常重編程。基因組的重新編程是高度復雜的過程，需要及時激活和關閉決定蛋白質正確表達的基因。異常的表觀遺傳重編程包括DNA甲基化、組蛋白修飾、X染色體失活、基因組印記［65］等。Jyotsana等［32］表明水牛克隆胚胎中存在高度的DNA甲基化和組蛋白乙酰化，其基因表達模式與體外受精胚胎中的表達模式不同。Suteevun等［66］表明DNA的甲基化水平在2細胞期到8細胞期不斷降低，到桑椹胚開始不斷增加，在囊胚期達到最高。同時，桑椹胚期組蛋白乙酰化水平最低。另外，近期研究表明手工克隆囊胚與體外受精相比，表觀遺傳修飾不同［32，63］。此外經研究發現組蛋白修飾中組蛋白3賴氨酸9（Histone 3 Lysine 9，H3K9）甲基化是細胞重編程的主要障礙之一［67］。同樣，組蛋白3賴氨酸27（Histone 3 Lysine 27，H3K27）的甲基化水平高被認為是細胞重編程的重要障礙［68］。同時，克隆胚胎也會發生異常的組蛋白乙酰化修飾。也有科研人員確定組蛋白3賴氨酸4（Histone 3 Lysine 4，H3K4）甲基化為主要的表觀遺傳學障礙［69］。眾多科研人員的研究結果為提高HMC克隆效率奠定了理論基礎。

圖1 手工克隆技術程序（改自Verma［23］等）

4 手工克隆效率的提高

對于體細胞的選擇，卵母細胞的選擇，卵母細胞的去核程序，重構胚的培養條件，重構胚的融合-激活，科研人員已經將其優化，文中已詳細闡述。對于異常的表觀遺傳修飾，科研人員已通過不同方法來修復異常重編程。這些方法主要通過表觀遺傳修飾劑或者表觀遺傳抑制調控因子來修復供體細胞或胚胎的表觀遺傳編程狀態，對囊胚率和胚胎質量有明顯改善［70］。研究證明，S-腺苷高半胱氨酸［71］、5-氮雜 -2'-脫氧胞苷［72］和 RG108［73］能夠降低DNA甲基化水平，并且提高囊胚率。對于提高組蛋白乙酰化水平方面，科研人員直到目前已經進行了大量研究，如通過提高組蛋白賴氨酸各位點乙酰化水平來提高HMC囊胚率。吳霄等［74］通過體外轉錄獲得賴氨酸特異性脫甲基酶4B（Lysine-specific demethylase 4B，KDM4B）和賴氨酸特異性脫甲基酶 4D（Lysine-specific demethylase 4D，KDM4D）mRNA并將其分別顯微注射至豬克隆胚胎，結果表明過表達KDM4B可以顯著提高豬克隆胚胎的囊胚率。Zhang等［75］于2018年用重組人KDM4D蛋白對供體綿羊胎兒成纖維細胞進行處理，結果顯示H3K9三甲基化和H3K9二甲基化水平均降低。Liu等［45］于2018年用TC在猴供體細胞中注射KDM4D mRNA并用組蛋白去乙酰基酶抑制劑曲古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）處理，大大提高了代孕猴的胚泡發育和核移植胚胎的妊娠率。目前用HMC技術對供體細胞或胚胎進行特異性去甲基化酶處理的研究甚少。眾多科研人員的研究為HMC克隆效率的提高提供了新思路。但目前沒有確切的數據能夠表明特異性去甲基化酶可以提高HMC胎兒出生率。表觀遺傳因子對HMC胚胎中的重編程的作用仍需研究。酶和H3K27去甲基化酶降低甲基化水平從而提高克隆效率。但是異常的表觀遺傳機制仍不明確，是目前研究HMC的存在問題，今后需要科研人員對表觀遺傳的機制進行不斷研究。另外，對于去甲基化酶的研究仍不夠深入，特異性去甲基化酶對供體細胞或胚胎的不同處理方式對HMC克隆效率的影響仍需今后對其進行研究。通過克服HMC中存在的問題和難題來更好地優化HMC體系，提高HMC的克隆效率，更加廣泛地應用到畜牧生產實踐中去，為家畜的品種改良及優良品種的擴繁提供技術支撐，為拯救瀕危物種鋪平了道路，還可以利用HMC結合基因編輯技術為生產轉基因動物用于疾病模型和生物制藥、用于生產所需患者特異性干細胞再生療法中。

5 HMC的展望

相比TC，HMC在克隆過程中所需設備成本較低，操作較簡單，需要掌握的專業知識較少，并且囊胚率和活產率較高。因此HMC得到不斷發展并克隆出多種動物。目前HMC的操作技術方法已經得到完善，但是克隆效率仍較低，另外使用異質性細胞質及透明帶的缺失可能會影響HMC胚胎生產效率，同時由于異常表觀遺傳重編程的存在，HMC的克隆效率相比體內受精和體外受精較低。研究已發現H3K9甲基化和H3K27甲基化水平高是細胞重編程的主要障礙，并且可以通過添加H3K9去甲基化