基于CRISPR/Cas系統的生物傳感策略研究進展

胡孝林 王良婷 顧瑋 羅陽

（1. 重慶大學生物工程學院，重慶 400044；2. 重慶大學醫學院，重慶 400044）

CRISPR/Cas技術作為一種革命性的基因編輯工具，被廣泛應用于基因編輯、基因組成像等領域。因其獨特的精準識別能力，CRISPR/Cas系統在生物傳感領域也展現出廣闊的應用前景。近年來，通過與核酸擴增技術聯用，CRISPR生物傳感系統已將檢測特異性提高到單堿基水平，并在不同亞型的病毒鑒別領域取得了突破性的進展，正日趨成為臨床核酸檢測的有利工具。本文主要就CRISPR生物傳感系統的最新研究進展進行綜述。

1 常見CRISPR/Cas系統及其工作原理

1.1 CRISPR/Cas系統簡介

CRISPR/Cas系統由簇狀規則間隔短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和CRISPR關聯蛋白（CRISPR associated，Cas）組成，是一種古生菌和細菌的適應性免疫系統［1-2］。CRISPR/Cas系統主要包括Cas基因序列、前導區、重復序列區和間隔區（圖1）［3］。CRISPR/Cas系統種類繁多，根據發揮作用的蛋白類型，大致可分為兩類：1類為多蛋白效應復合物；2類為單一效應蛋白。目前常見的Cas9、Cas12a、Cas13a均屬于第2類（表1）［4］。近年來，CRISPR/Cas技術發展迅速，已被大量應用于基因修飾［5］、基因治療［6］、生物傳感［7］等領域。

圖1 CRISPR/Cas系統示意圖

1.2 CRISPR/（d）Cas9系統

CRISPR/Cas9是第一個應用于基因工程的CRISPR/Cas系統。Cas9蛋白含有HNH和RuvC兩個核酸酶結構域，能夠對雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）進行定點編輯［8］。其原理是CRISPR系統在轉錄并處理后形成由CRISPR RNA（crRNA）和反式作用crRNA（tran-activating CRISPR RNA，tracrRNA） 構 成 的 單 導 RNA（single guide RNA，sgRNA）。Cas9蛋白在sgRNA引導下形成Cas9-tracrRNA-crRNA復合物，通過掃描外源DNA序列，定位到前間隔序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）位點（通常為5'-NGG）。隨后，雙鏈DNA被部分打開，crRNA與互補鏈雜交，Cas9蛋白中的HNH結構域部分切割雜交DNA鏈，而RuvC結構域部分切割游離鏈，造成目標DNA雙鏈斷裂［9-10］。2013 年，Gilbert等［11］通過引入催化失活突變，使Cas9的RuvC和HNH兩個結構域失去剪切dsDNA能力，形成Cas9的突變體dCas9。dCas9既能特異性靶向dsDNA，又保留了dsDNA結構的完整。通過在dCas9上標記各種功能蛋白，可構建相應的生物傳感器以檢測靶標序列，較傳統的原位雜交技術具有更高的特異性［12-13］，進一步拓展了CRISPR/Cas系統在生物傳感中的應用。

表1 常見CRISPR/Cas系統特點

1.3 CRISPR/Cas12a系統

CRISPR/Cas12a系統是由RNA引導的DNA靶向CRISPR系統。Cas12a又名Cpf1，是一種由RNA介導的核酸內切酶，包含一個RuvC核酸酶結構域，由張鋒團隊于2015年發現。與Cas9相比，Cas12a具有3個特性：（1）Cas12a能催化其自身的crRNA成熟，不需要tracrRNA參與；（2）Cas12a-crRNA復合物通過靶向一個短的T核苷酸豐富的PAM位點實現對靶DNA序列的精準切除；（3）Cas12a切割dsDNA后，會產生 4-5個核苷酸的 5'缺口［14-15］。2018年，Jennifer Dounda團隊［16］在研究Lachnospiraceae bacteriumND2006 Cas12a（LbCas12a）和Streptococcus pyogenesCas9（SpCas9）時發現，在 sgRNA引導下，LbCas12a能夠快速的降解單鏈M13DNA噬菌體而SpCas9不能。由此提出了LbCas12a在與靶DNA結合后具有強大的非特異性裂解單鏈DNA（singlestranded DNA，ssDNA）的能力，即“附屬切割”活性，為CRISPR/Cas系統在生物傳感中的應用提供了一個新的思路。

1.4 CRISPR/Cas13a系統

CRISPR/Cas13a系統是由RNA引導的RNA靶向CRISPR系統。Cas13a又名C2c2，含有兩個HEPN結構域，由Broad研究所最早發現［17］。Cas13a與Cas12a相似，都只需要crRNA引導，但CRISPR/Cas9和Cas12a在序列特定位點附近與crRNA互補的位置切割DNA，而Cas13a是在crRNA互補位置外的側翼序列附近切割靶RNA。2016年，Abudayyeh等［18］在進行Leptotrichia shahiiC2c2（LshC2c2）的體外切割實驗時發現，在靶RNA存在的情況下，LshC2c2-crRNA復合物不僅可以切割靶RNA，還可以非特異性地切割側枝單鏈RNA（singlestranded RNA，ssRNA）。Cas13a的“附屬切割”活性具有應用于快速、高靈敏度、高特異性的生物傳感器的潛力。

2 CRISPR/Cas系統在生物傳感中的應用

生物傳感器是將生物信號轉化為其他可定量的信號的檢測技術，主要可以分為核酸傳感器、酶傳感器、免疫傳感器等，近年來發展迅速。CRISPR/Cas系統作為基因編輯工具，大多應用于分子傳感器，解決其特異性問題。目前已建立的一系列分子傳感器大多是將擴增技術與CRISPR/Cas系統進行整合，但各傳感器在靶標分子類型、Cas效應器類別、擴增方法上存在根本差別。本文主要綜述了CRISPR/Cas系統在DNA、RNA及其他分子傳感中的應用。

2.1 DNA傳感

傳統的生物傳感器在檢測靶標分子時，通常需要擴增以實現低濃度檢測。PCR是一種經典核酸擴增技術，但因擴增時間長，逐漸被擴增時間更短，效率更高的等溫擴增替代。喻學鋒團隊［19］開發了一種CRISPR/Cas9觸發的內切酶介導的鏈置換擴增（CRISDA）檢測系統，具有aM靈敏度和單堿基特異性。CRISDA使用等溫擴增反應鏈替代擴增（Strand displacement amplification，SDA）作為擴增手段，利用HNH結構域失活的Cas9切割打開靶DNA的一條鏈，隨后引物結合啟動SDA反應，利用肽核酸探針進行讀數。CRISDA可用于全基因組定點檢測，在復雜的背景干擾下仍然具有高特異性和靈敏度。除此之外，CRISDA通過引入等溫擴增技術，打破了傳統DNA傳感器對于設備的依賴性，在核酸的現場即時檢測中擁有巨大的應用潛力。同時簡化了操作步驟，只需進行簡單的引物設計即可在一個溶液體系里完成所有操作，縮短了檢測時間，在特異性上也有所提升。但受限于SDA的擴增效率，CRISDA在靈敏度上具有一定的提升空間。

指數擴增反應（Exponential amplification reaction，EXPAR）是一種極為快速的核酸等溫擴增技術，可在0.5 h內擴增到106-108倍。但EXPAR非特異性擴增明顯，限制了其應用。Huang等［20］將CRISPR/Cas9與EXPAR聯用開發了Cas-EXPAR檢測系統用于ssDNA的快速超敏檢測，具有aM靈敏度和單堿基特異性。該系統通過一個獨立的反義PAM寡核苷酸來激活CRISPR/Cas9靶向dsDNA特定位點并切割。切割產物可以觸發EXPAR，產生大量靶標dsDNA片段，并與SYBR Green I染料結合顯色（圖2）。Cas-EXPAR充分利用了CRISPR/Cas系統精準識別并切割的特性，除去體系中不需要的多余片段，解決了EXPAR的非特異性擴增問題，極大的提升了檢測速度和檢測效率。但該檢測方法需要對dsDNA進行預處理，仍難以應用于現場即時檢測。

Cas12a是由RNA引導的核酸酶，具有結合靶標后非特異性裂解ssDNA的能力。王金團隊［21］首次將CRISPR/Cas12a應用于DNA傳感，將CRISPR/Cas12a與PCR聯用開發了快速靈敏的HOLMES（an one-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System，HOLMES）系統。隨后對其進行優化，將Cas12b與擴增效率更高的環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）結合開發了HOLMES version2（HOLMESv2） 系 統［22］。Cas12b 同 樣具有結合dsDNA靶標后非特異性裂解ssDNA的能力，且Cas12b切割特異性更高，但臨床樣本的檢測仍具有一定難度。

基于此，Jennifer Doudna團隊［16］開發了DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR）生物傳感平臺，可準確和快速的檢測人乳頭瘤病毒（HPV），且能鑒別不同HPV亞型，具有aM靈敏度。DETECTR使用重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA）擴增含有HPV16的質粒，將擴增后的HPV16質粒、以HPV16為靶標的LbCas12a-crRNA復合物、ssDNA熒光猝滅基團共培養。LbCas12a-crRNA復合物結合靶標DNA后，激活了其“附屬切割”活性，切割體系中的ssDNA熒光猝滅基團，產生熒光信號。但用以HPV18為靶標的LbCas12a-crRNA復合物時，不能檢測到熒光信號。與其他新型DNA傳感器相比，DETECTR不僅做到了單一病毒的檢測，還能夠區分出序列極為類似的病毒不同亞型，使現場即時檢測結果的判斷更為準確。同時DETECTE具有檢測復雜樣本的能力，在臨床樣本檢測時，識別HPV16樣本檢測準確率達到100%，HPV18樣本達到92%，在臨床診斷、現場檢測中擁有巨大的應用前景。然而DETECTR存在擴增和切割步驟需分離開的弊端，增加了檢測時間。Wang等［23］提出了一種基于CRISPR/Cas12a的快速核酸傳感策略（Cas12aVDet），將Cas12a附著在管壁上，在RPA擴增后通過離心的方式使Cas12a加入體系，實現一體化檢測。該方法將檢測時間縮短到了0.5 h左右，超過了目前已知的絕大部分檢測方法。CRISPR芯片的出現進一步擴展了CRISPR-Cas9技術在DNA傳感中的應用，使CRISPR傳感器在無需擴增的情況下仍然具有較高靈敏度［24-25］。

圖2 Cas-EXPAR檢測ssDNA原理［20］

近年來，不斷有新的Cas蛋白被發現，如Cas12b、Cas14a等。這些新型Cas蛋白被報道同樣具有識別靶標后的“附屬切割”活性。Teng等［26］開發了一種Cas12b介導的DNA檢測系統（CDetection），同樣用于HPV16和HPV18的鑒別。CDetection檢測原理與DETECTR類似，但相比于Cas12a和Cas12b對dsDNA的切割具有更高的活性和特異性，因此CDetection在檢測靈敏度上優于DETECTR。而與同樣用Cas12b的HOLMESv2相比，CDetection使用了更為高效的RPA作為擴增手段，且使用了dsDNA激活劑輔助Cas12b激活其“附屬切割”活性，提高了檢測的靈敏度。CDetection在分子診斷和臨床研究具有應用潛力，但是其臨床樣本檢測效果較差，仍需進一步優化提高檢測準確性。

Cas14蛋白是一種RNA引導的ssDNA靶向蛋白，其大小僅為目前已知的2類Cas效應器的一半，但其獨特的ssDNA靶向性為DNA傳感提供了新的思路。Jennifer Doudna團隊［27］在DETECTR的基礎上，將Cas12a換成Cas14a，開發了一種單核苷酸多態性基因分型系統（Cas14-DETECTR）。Cas14-DETECTR用含磷酸的引物擴增DNA底物，以保護單鏈不被外切酶降解。擴增完成后，添加T7外切酶，未經修飾的鏈會被降解，留下可由Cas14a檢測的ssDNA底物。該方法選擇了人類HERC2基因上一個負責眼睛顏色的單核苷酸多態位點作為檢測對象，可鑒別藍眼和褐眼兩種不同類型的基因。Cas14蛋白的高保真度使Cas14-DETECTR能更為真實的反應結果。除此之外，Cas14蛋白在直接檢測ssDNA病毒也擁有廣闊的應用前景。

2.2 RNA傳感

RNA病毒占據了病毒的大部分，如何快速檢測RNA病毒成為了急需解決的問題。然而目前大多數RNA傳感系統缺乏高特異性，在實際應用中受到阻礙。2016年，Collins教授［28］等首次將CRISPR/Cas9系統應用于RNA傳感，開發了紙基寨卡病毒不同亞型檢測傳感器（NASBA/CRISPR Cleavage，NASBACC），實現了不同寨卡病毒亞型的區分。利用依賴核酸序列的擴增技術（Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）對目標RNA進行高效擴增，擴增產物可打開試紙條上toehold生物傳感器的發卡結構，激活Lacz酶合成，通過生化反應產生肉眼可見的顏色變化，以檢測寨卡病毒。進一步將樣本與CRISPR/Cas9結合，利用CRISPR/Cas9系統對PAM序列精準的特異性識別，鑒別寨卡病毒不同亞型（圖3），可在3 h內讀出結果，檢出限達到fM水平。NASBACC是第一個使用CRISPR/Cas系統進行病毒亞型鑒別的傳感器，通過設計特異的sgRNA，可使Cas9對不同病毒亞型序列展現出不同的切割活性，解決了寨卡病毒現場即時檢測的難題。但Cas9僅僅只能對靶標序列進行切割，當靶標濃度過低時，往往無法產生可讀出的信號結果。

圖3 NASBACC檢測RNA原理［28］

Cas13a是一種由RNA引導的核酸酶，在crRNA引導下可特異性結合ssRNA，并展現出驚人的附屬ssRNA切割活性。目前的Cas效應器大多是以DNA為靶向目標，因此在RNA傳感器構建時需要額外的逆轉錄步驟，使操作更為繁瑣，而Cas13a獨特的ssRNA靶向性解決了此問題。基于此，張鋒團隊［29］開發了鑒別寨卡病毒不同亞型的SHERLOCK（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing）傳感系統。該系統使用RPA對靶標進行擴增，可在短時間內擴增出大量目的片段，極大地提高了其檢測的靈敏度。并利用Cas13a的“附屬切割”活性切割體系中的熒光報告基團，產生可定量的信號（圖4）。SHERLOCK展現出aM靈敏度及單堿基的特異性，遠遠超出了臨床檢測要求。但仍然存在一定的局限性：（1）RPA擴增后目標DNA拷貝數過多，導致熒光報告基團飽和；（2）需額外的輔助設備。

圖4 SHERLOCK檢測dsDNA和RNA原理［29］

為了解決上述問題，張鋒團隊［30］開發出超敏、便攜、可多重檢測的SHERLOCK version 2（SHERLOCKv2）傳感系統。相較于SHERLOCK，SHERLOCKv2具有以下優點：（1）將輔助性CRISPR酶Csm6與Cas13a耦合實現信號增強，將靈敏度提高了3.5倍；（2）減少了等溫擴增時引物的加入量，避免熒光報告基團飽和；（3）簡單便攜；（4）篩選了4種不同的Cas效應器分別切割各自特異性的ssDNA 熒光報告基團，可同時檢測4種不同類型的病毒。但SHERLOCKv2無法直接檢測人的體液樣本，限制了其在實際生活中的應用。Myhrvold等［31］通過將SHERLOCK與不經核酸提取熱處理樣品滅活核酸酶技術相結合，可以在不經DNA/RNA提取和純化步驟的情況下，直接從臨床樣本中檢測病毒核酸，極大地簡化了操作步驟，使SHERLOCK技術在生物傳感的應用得到進一步的加強。

除了檢測寨卡病毒RNA，CRISPR傳感器還被用于檢測多種微小RNA（microRNA，miRNA）。miRNA是許多癌癥的生物標志物，通過胞外囊泡傳遞［32］，若能在癌癥早期實現精準、超敏檢測，將具有廣闊的應用前景［33］。Qiu等［13］將滾環擴增技術（Rolling circle amplification，RCA）、辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）和 CRISPR/dCas9系統結合開發了RCA-CRISPR-split-HRP（RCH）平臺，低成本、高效檢測miRNA。RCA擴增后，將dCas9蛋白預先與分離的HRP報告片段結合。在sgRNA的引導下，可在擴增產物的莖環結構周圍重新聚集HRP蛋白，從而激活HRP活性。利用3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺顯色反應檢測靶miRNA（圖5）。該方法可在4 h內讀出結果，靈敏度達到fM級別，且能夠檢測出具有單堿基特異性的miRNA。RCH通過RCA的特點將靶標RNA轉化成dCas9可識別的莖環結構，并利用dCas9蛋白的可修飾性使信號讀數方式更加簡便。

除了miRNA傳感外，CRISPR系統也可應用于mRNA傳感。Li等［34］開發出一種基于邏輯門的mRNA傳感系統。該系統設計了一種具有莖環結構的mRNA傳感的向導RNA（sgRNA），只有在同時存在mRNA和Cas9時才能觸發其切割活性，產生可讀出的熒光信號。通過直接對sgRNA進行修飾使其作為一種傳感分子，為CRISPR傳感系統提供了一個新的思路。

2.3 其他分子傳感

雖然目前已發現的CRISPR/Cas系統都是靶向核酸，但通過一定的信號轉換也可實現其他分子的檢測。Liang等［35］利用細菌變構轉錄因子（aTFs）對小分子的敏感性，開發了一種可檢測小分子的 CRISPR傳感策略（CaT-SMelor）。aTFs通常包括DNA結合域和效應小分子結合域，將aTFs與dsDNA連接，當靶標小分子存在時，小分子會與aTFs結合并改變其構象，使dsDNA脫落從而觸發Cas12a的“附屬切割”活性切割熒光報告集團產生熒光信號。CaT-SMelor已成功實現了對人血液樣本中尿酸的檢測，且通過選擇不同的aTFs，有望實現其他多種小分子的檢測?，F目前用于核酸檢測的CRISPR傳感器種類繁多且各有特點（表2），但用于檢測其他生物分子的傳感器數量仍然非常少，有待進一步開發。

圖5 RCH檢測miRNA原理［13］

表2 典型CRISPR傳感器特點

3 總結與展望

近年來，CRISPR傳感器逐漸往更便攜、快速、靈敏的方向發展，且如今的CRSIPR傳感器已不再局限于單一病毒DNA或RNA的傳感，而是更偏向于多重檢測及亞型鑒別?；贑RISPR/Cas9的生物傳感器，如Cas-EXPAR、CRISDA等，在特異性上高于傳統生物傳感器。但由于受到Cas9蛋白自身特性的限制，其讀出信號的高低完全取決于靶標DNA的濃度，難以在靈敏度上有進一步的提升。基于Cas12a，Cas13a，Cas14的生物傳感器，如SHERLOCK，DETECTR等，利用Cas蛋白的“附屬切割”活性對信號進行了第二次放大，使其在靈敏度、特異性、便攜性上均更有提升，在未來也將擁有更好的發展前景。

盡管CRISPR/Cas系統在生物傳感領域已被成功應用，但仍存在許多共性問題亟待解決：（1）不能實時監測：現有的基于熒光或顯色反應的生物傳感策略只能在反應結束后通過肉眼或儀器讀出結果，無法觀測整個過程；（2）無法做到真正的通用檢測平臺：CRISPR/Cas系統中sgRNA不同則其靶向的目標也不同，且不同的靶標結合能力也不同；（3）環境差異可能影響檢測結果：這些檢測系統是在實驗室條件下開發出來的，若今后應用于與實驗室相比差異較大的環境時，其效果有待觀察。因此，CRISPR生物傳感系統仍然有較大的提升空間。

在過去的幾年中，陸續發現了許多多功能的Cas蛋白酶（Cas12a、Cas13a等），未來也將會有更多這樣的Cas酶被發現。這些酶或許可以再次提高CRISPR生物傳感器的靈敏度等。而各種等溫擴增技術的不斷改進，也為CRISPR生物傳感器的發展提供了另一個思路。這些新的CRISPR/Cas生物傳感器或將徹底改變人們對傳染病和遺傳病快速、敏感和準確診斷的認識。