稻香相關基因OsBADH2在“吉粳88”中的基因編輯研究

周巖 郭嘉 胡玉鋒，4 魏健 李毅丹

（1. 長春師范大學生命科學學院，長春 130032；2. 吉林省農業科學院農業生物技術研究所，長春130033；3. 吉林省農業生物技術重點實驗室 吉林省農業科學院，長春 130033；4. 吉林師范大學生命科學學院，四平136000）

香味品質已經成為消費者選擇稻米的重要指標。然而，市售優質香稻品種較少，特別是在口感良好的粳稻品種中，香味品質突出的則更為稀缺。因此，對優質粳稻材料進行改良，提升其香味品質，將具有廣闊的市場前景。1979年Yajima等［1］在米飯中檢測到114種具有香味的揮發性化合物。其中，2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）是影響稻米香味的主要化合物［2］。2-AP前體物質Δ-1-吡咯啉（1-pyrroline）的代謝是由甜菜醛脫氫酶Ⅱ（Betaine aldehyde dehydrogenase 2，BADH2）催化的，水稻內源BADH2活性降低會導致2-AP含量增加，進而會提升水稻的香味［3］。水稻OsBADH2基因現已成為改良水稻香味品質的一個關鍵目標基因。

CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）技術是目前應用最為廣泛的基因組編輯技術［4］。因其具有準確性高、細胞毒性小、可同時對多個目標基因進行編輯等優勢，已被應用在水稻等主要作物的遺傳改良中［5］。目前已有報道使用CRISPR/Cas9技術在水稻中編輯OsBADH2基因，并獲得了badh2突變體材料［6-9］。這些研究均采用了農桿菌介導的穩定遺傳轉化方法，這種方法需要進行4-5周的抗性篩選，而利用這一方法獲得T0材料后，至少需經過一次自交才能在后代中獲得無轉基因成分的基因編輯后代材料，并且仍需要進行一代甚至多代的回交，才能最終獲得編輯靶點純合的突變材料，突變材料創制和篩選耗時較長。2016年，高彩霞課題組利用基因槍介導的瞬時轉化方法，在小麥中建立了高效的CRISPR/Cas9基因編輯體系［10］。該體系為快速獲得基因組編輯粳稻材料提供了新思路。另外，基因編輯后代材料的分子檢測也是基因組編輯體系中的重要環節。目前，利用PCR擴增、限制酶酶切和測序相結合的檢測方法應用較多，但仍存在著耗時長、成本高等不足。而隨著高分辨率溶解曲線（High resolution melting，HRM）技術被引入到在基因編輯后代材料的分子檢測［11-12］，有效的降低了成本，提高了檢測效率。因此，本研究通過基因槍介導的瞬時轉化體系對“吉粳88”進行基因編輯，敲除調控水稻香味的OsBADH2基因，并利用HRM技術對基因編輯后代材料進行分子檢測，預期在T1代獲得無轉基因成分且編輯位點純合的“吉粳88”badh2突變體，為香味粳稻育種提供新的種質資源。同時，也對基于瞬時表達的粳稻基因組編輯技術體系進行探索和完善。

1 材料與方法

1.1 材料

以粳稻“吉粳88”為轉化材料，轉化實驗于2017-2018年在吉林省農業科學院完成。基因編輯后代材料在吉林省農業科學院公主嶺院區溫室中盆栽種植。大腸桿菌（DH5α）感受態細胞，基因編輯載體均來源于吉林省農業科學院。實驗所用引物的合成以及PCR產物測序工作由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 OsBADH2靶點的選擇 首先，對“吉粳88”的OsBADH2基因進行全長擴增（引物見表1）并測序，測序結果與NCBI數據庫中的OsBADH2基因參考序列（Gene ID：105128600）比對，確定保守區域；進而使用在線工具CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/）在基因保守區域中選擇候選靶點；最后，為避免出現脫靶，在水稻全基因組數據庫RADB（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp）以及NCBI數據庫中對候選靶點進行特異性檢驗，最終確定靶點。

1.2.2 CRISPR/Cas9 表達載體構建 分別構建含有不同靶點序列的gRNA表達盒，表達盒中的靶點序列由U6啟動子驅動，并在sgRNA scaffold后添加NOS終止密碼。XbaⅠ和PstⅠ雙酶切后，將gRNA表達盒連入pJSCRISPR/Cas9載體（圖2）。

1.2.3OsBADH2基因編輯材料的創制 去穎殼的“吉粳88”籽粒經1 ‰的升汞溶液浸泡處理8 min后，無菌水清洗5次。消毒后的種子在NS和NS1培養基（表2）中分別進行愈傷組織誘導和繼代。使用基因槍法對所獲愈傷組織進行遺傳轉化。轉化后的愈傷組織在NS1培養基（表2）上恢復培養48 h。恢復處理后的愈傷組織于MD培養基（表2）上誘導成苗。將株高約1.5-2 cm的T0代再生苗轉至MR培養基（表2）誘導生根。參照李楠等［13］的粳稻愈傷組織的培養方法，培養條件為全程光照，光照強度1 600 lux，室溫29℃。挑選根系茁壯的T0植株在溫室中煉苗2-3 d后移栽。

1.2.4 基因編輯材料的分子檢測 為檢測靶點的編輯情況，針對不同靶點，設計特異的HRM檢測引物（表1），并進行PCR擴增。PCR反應體系為：2× Phanta Max Master mix 10 μL；上下游引物各0.5μL ；EvaGreen 0.5 μL ；DNA 模 板 1 μL ；水 7.5 μL。PCR反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，共35個循環；72℃ 5 min；95℃ 30 s后，以每秒0.1℃降溫至40℃；4℃保存。使用LightScanner（Idaho Technology，美國）進行HRM分析，根據溶解曲線差異，將鑒定為序列發生變化的PCR擴增產物，進行測序驗證，確定靶點編輯類型。

表1 引物信息

2 結果

2.1 基因編輯靶點的選擇

使用CRISPR-GE最終在OsBADH2基因的第2、第3和第4外顯子區選擇了3個編輯靶點（圖1-A），并分別合成了gRNA表達盒連接入pJSCRISPR/Cas9載體中（圖1-B）。

2.2 基因編輯材料的創制

通過對李楠等［13］的粳稻組培再生體系進行優化，建立了一套僅需約70 d，即可完成從成熟胚誘導愈傷到最終獲得T0代陽性植株的組培再生體系。該體系僅使用了NS、NS1、MD、MR四種培養基（表2）。首先，成熟胚在NS培養基中誘導培養7-10 d即可獲得淡黃色且蓬松的愈傷組織；再經過7-10 d的繼代培養，愈傷組織可增殖一倍以上。在MD培養基上僅需14 d的分化培養即可獲得分化苗，每皿12塊初始愈傷經分化培養后，可獲得8-20株分化苗；在MR培養基上，分化苗的生根率為100%，且易于移栽，移栽成活率也可達到100%。利用基因槍法介導的瞬時轉化，組培過程中省略了抗生素的篩選，因此獲得分化苗的周期并未增長。最終，獲得靶點1的T0代基因編輯再生苗270株，靶點2的基因編輯T0代再生苗296株，靶點3的基因編輯T0代再生苗281株。

2.3 基因編輯材料的分子檢測

為快速檢測所獲得的后代材料是否在設計靶點位置發生了編輯，本研究利用HRM檢測技術對T0和T1代材料進行了分子鑒定。HRM檢測結果（圖2）顯示，后代材料的目標片段PCR擴增產物的溶解曲線可清晰的區分突變體與野生型。經測序驗證，HRM檢測鑒定出的突變體，其靶點序列均發生了編輯。編輯類型主要為單堿基或多堿基缺失，以及部分堿基的替換。

表2 培養基組分

為獲得編輯位點純合突變且無轉基因成分的基因編輯后代材料，我們對T1代材料進行了潮霉素抗性基因的PCR檢測。潮霉素檢測為陰性的樣品，進一步利用HRM分析結合測序驗證，檢測編輯靶點的純合性。結果顯示3個編輯靶點的T1代材料中，均獲得了純合靶點編輯且無轉基因成分的基因編輯材料，其中靶點1 編輯有3類，靶點2編輯有2類，靶點3編輯有2類（圖3）。HRM檢測不但能將編輯靶點上發生多堿基缺失的材料（如：T1-C-2-16）與野生型材料清晰的區分，而且對編輯靶點只發生單堿基缺失的材料（如T1-C-2-22），也能明確的檢出（圖4）。說明HRM檢測非常適用于基因編輯后代材料的檢測。

圖1 pJSCRISPR/Cas9表達載體與基因編輯靶位點

圖2 突變材料的HRM分析與測序驗證

圖3 T1純合等位基因突變體比對分析

3 討論

“吉粳88”是稻米品質達到國家一級標準的粳稻品種。2005年至今，由其作為育種親本而獲得認定的粳稻優質品種共有72個。進一步改良吉粳88的香味品質，迎合市場對稻香米的需求，具有重要的育種價值。CRISPR/Cas9技術相對于鋅指蛋白（Zinc-finger nucleases，ZFNs）技術和TALEN 核酸 酶（Transcription activator like effector nucleases，TALENs）技術，更為簡單、高效，在植物基因組編輯的研究領域已得到了廣泛的應用［15］。目前，對水稻OsBADH2基因進行CRISPR/Cas9基因編輯的研究已有報道［6-9］，而這些研究均選擇了農桿菌介導的穩定遺傳轉化方案。農桿菌介導的遺傳轉化，必須要經過轉化后的抑菌以及對愈傷組織的抗性篩選等過程，最終獲得基因編輯突變體通常需要2-3年的時間。相對于農桿菌轉化而言基因槍轉化容易導入多個拷貝，因此在轉基因轉化中不被廣泛使用。鑒于CRISPR/Cas9技術不需要載體整合到基因組持續發揮功能這一特點，在轉化階段多拷貝的導入反而增大導入片段發揮功能的概率，因此我們認為基因槍轉化與植物基因組編輯具有更高的契合度。2016年，高彩霞課題組在小麥中建立了高效的CRISPR/Cas9基因編輯體系，該體系采用了基于基因槍轉化的瞬時表達體系，且減少了抗性篩選過程，大大縮短了成苗時間［10］。本研究借鑒了該研究成果的成功經驗，采用基因槍介導的瞬時轉化體系，針對3個OsBADH2基因編輯靶點分別進行了編輯，在50-60 d即可獲得T0代材料。分子檢測結果發現OsBADH2基因3處靶點均獲得了發生序列變異的后代材料。OsBADH2基因靶點的編輯類型主要以小片段的堿基缺失為主。在T1代材料中，成功的篩選出了badh2突變體。

圖4 純合無轉基因成分編輯材料的分子驗證

在規模化的基因編輯育種工作中，后代材料的分子檢測是重要的一環。盡管RFLP分析（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）［15-16］、dCAPS衍生分析（derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS）［17-18］、限制性酶切PCR法（Restriction enzyme-PCR，RE-PCR）［19-20］以及測序分析能夠滿足編輯后代材料的鑒定需求［21］。然而，這些方法耗時長、成本高，不適合規模化基因編輯育種工作。因此如何提高基因編輯后代材料的檢測效率、降低檢測成本，成為了優化基因編輯育種體系的重要方面。

HRM是一種針對小片段核酸多態性進行精準分型的檢測技術。Andrew等［22］在2014年就應用HRM檢測成功鑒別出基因編輯果蠅的突變體；隨后Thomas等［23］將該技術系統的應用在基因組編輯的斑馬魚突變體的檢測中；Chen等［11］使用HRM技術鑒別番茄的不同基因編輯突變體。上述研究表明HRM技術可應用于動植物基因編輯后代材料的分子檢測。2010年，Li等［24］建立的基于EvaGreen的HRM體系，將HRM檢測成本降低至96個反應2美金，推動了HRM的廣泛應用。為了進一步的加快粳稻基因編輯效率，降低編輯材料鑒定成本，本研究引入了HRM技術對基因編輯后代材料進行鑒別。結果表明HRM技術可以在1.5 h內完成檢測，大大縮短了檢測時間。

評價稻米香味品質是培育香稻的重要環節，但目前尚未有評價稻米香味的通用標準。以往的研究中對香米的評價方式主要為KOH法檢測水稻分蘗期葉片的氣味，口嚼法檢測水稻種子的味道，以及GC-MS聯用檢測主要香味成分2-AP的含量等［25］。由于本研究的所獲得突變體材料有限，尚無法對突變體中2-AP進行檢測，本研究僅對葉片的香味表型做了感官性評價。通過采用KOH法對T1代基因編輯材料的葉片進行檢測，發現OsBADH2基因編輯材料與野生型對照相比，大部分badh2突變體的葉片香味增加。我們也發現了5株badh2不具有明顯的香味變化。Jang等［26］在OsIAA23中的研究發現，CRISPR基因編輯可誘發后代材料中的可變剪切，進而補償性的修復編輯位點的功能突變。因此，后續研究中我們將通過2-AP的含量的測定更準確的分析badh2突變體預期表型與基因型的對應關系，并解析部分badh2突變體不具備香味表型的機理。

4 結論

利用CRISPR/Cas9技術創制了一批OsBADH2基因編輯的“吉粳88”后代材料，并篩選獲得了香味性狀改良的后代編輯材料。建立了一套基于基因槍瞬時轉化的粳稻CRISPR/Cas9編輯體系和后代材料HRM檢測技術體系。