BE3型胞嘧啶堿基編輯器在谷氨酸棒桿菌中的開發及應用

黃華媚 白立寬 劉葉 李俊維 王猛 花爾并

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

David Liu研究團隊首次報道了基于鼠源胞嘧啶脫氨酶（rat APOBEC1，rAPOBEC1）與d/nCas9蛋白融合的胞嘧啶堿基編輯器BE（Base editor），實現在哺乳動物細胞中胞嘧啶（Cytosine，C）到胸腺嘧啶（Thymine，T）的單堿基轉換［4］。經過優化，融合rAPOBEC1、nCas9（D10A）以及尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白（Uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI）的BE3型胞嘧啶堿基器（rAPOBEC1-XTEN-nCas9（D10A）-UGI）編輯效率得到較大幅度提高，并在其它動植物和微生物中廣泛應用。與此同時，Akihiko Kondo研究團隊則將七鰓鰻來源的胞嘧啶脫氨酶（PmCDA1）與d/nCas9蛋白進行結合，開發了胞嘧啶堿基編輯器Target-AID（Activation-induced cytidine deaminase），實現在酵母和哺乳動物細胞中的應用［5］。隨后，David Liu研究團隊又突破性的開發了基于腺苷脫氨酶與CRISPR/Cas系統相結合的腺嘌呤堿基編輯器，可實現腺嘌呤（Adenine，A）到鳥嘌呤（Guanine，G）的單堿基轉換，進一步的豐富了堿基編輯系統的工具箱［6］。

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是一株生物安全且具有重要工業應用價值的底盤微生物，目前被廣泛應用于各種大宗化學品的工業化生產中［7］。本研究團隊率先在谷氨酸棒桿菌中開發了一種多元自動化的胞嘧啶堿基編輯方法（Multiplex automatedCorynebacterium glutamicumbase editing method，MACBETH），結合 PmCDA1與 nCas9（D10A）蛋白，實現C到T的編輯［8］；隨后，通過采用識別不同PAM的Cas9突變體，優化向導RNA（guide RNA，gRNA）的設計，開發腺嘌呤堿基編輯器等，進一步豐富了堿基編輯系統在谷氨酸棒桿菌中的應用［9］。而截至目前，應用較為廣泛的、基于BE3結構的胞嘧啶堿基編輯器尚未有在谷氨酸棒桿菌中的報道應用。由于BE3堿基編輯器的編輯窗口（PAM序列上游-13到-17位）與現有MACBETH技術編輯窗口（PAM序列上游-16到-20位）存在明顯差異，BE3型胞嘧啶堿基編輯器在谷氨酸棒桿菌中的開發與應用將進一步豐富基因組可編輯位點數量，為谷氨酸棒桿菌的工業化改造提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 本研究所用菌株和質粒均為作者所在實驗室保存和構建，詳見表1。

表1 本文所用的質粒與菌株

表2 本文使用到的引物

1.1.2 酶、引物及相關試劑盒 Q5 High-Fidelity DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶購自NEB公司。大腸桿菌感受態細胞制備試劑盒購自TaKaRa公司。2×Es Taq Master Mix（Dye）購自康為世紀有限公司。質粒小量抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司。重組試劑盒ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司。DNA回收試劑盒EZ geneTMGel/PCR Extraction Kit購自Biomiga公司。PCR引物由擎科生物有限公司合成。

1.1.3 培養基 LB培養基（g/L）：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母粉5 g；NCM培養基（g/L）：磷酸氫二鉀17.4 g，氯化鈉11.6 g，葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，檸檬酸三鈉0.3 g，硫酸鎂0.05 g，山梨醇 91 g，調 pH 至 7.2；BHIS 培養基（g/L）：BHI 18.5 g，山梨醇91 g，調pH至7.2；LBHIS 培養基（g/L）：蛋白胨5 g，氯化鈉10 g，酵母粉2.5 g，BHI18.5 g，山梨醇91 g。制備固體培養基時添加2%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 gRNA的設計 本研究所選用的gRNA序列均由sgRNAcas9軟件設計得出［10］，設計參數為：gRNA長度20 nt，GC含量30%-70%，采用DNA雙鏈計算，其他參數為軟件默認參數。

1.2.2 質粒構建 質粒pXMJ19-rACTS的構建：首先將鼠源胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1的序列按照谷氨酸棒桿菌密碼子的偏好性進行密碼子優化，由金斯瑞公司合成；以合成質粒為模板，用引物對rAPF/lk-R擴增獲得rAPOBEC1序列片段；以實驗室現有質粒pTadA-TadA7.10-nCas9（D10A）TS為模板，用引物對nC9-F/CAG-R2、CAG-F3/9sgcx-R和9sgcx-F/SD-R分別擴增得到另外3個載體框架片段；將上述獲得的四片段同源重組連接，具體操作參見ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit說明書，然后轉化E. coliDH5α感受態；最后，經PstI和NdeI雙酶切驗證，并對質粒進行測序，獲得正確質粒。

質粒pXMJ19-rACUTS的構建：將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）噬菌體PBS1來源的UGI蛋白的編碼基因進行谷氨酸棒桿菌密碼子優化，并由金斯瑞公司合成；以合成質粒為模板，用引物對UGI-F/R擴增得到UGI片段；以質粒pXMJ19-rACTS為模板，擴增獲得其他載體片段；通過多片段同源重組、轉化E. coliDH5α感受態、酶切驗證以及測序，最終獲得正確質粒。

定理1 (Rolle中值定理)若f滿足：(i)f在閉區間[a,b]上連續；(ii)f在開區間(a,b)內可導；(iii)f(a)=f(b)，則在(a,b)內至少存在一點ξ，使得f′(ξ)=0.

質粒pXMJ19-rACU-gRNA：：ccdBTS的構建：以實驗室保存質粒pnCas9（D10A）-AID-gRNA-ccdBTS為模板，用引物CAG-gRNA-F/SD-R、CAGF3/180824-R分別擴增得到兩個含ccdB基因的骨架片段；以pXMJ19-rACUTS為模板，用引物rAPF/cx180322-2R、cx180322-2/UGI（-BsaI）-R、UGI（-BsaI）-F/CAG-R2分別擴增得到含rAPOBEC1-nCas9和UGI編碼基因的片段；多片段同源重組后，轉化到E. coliDB3.1感受態；經酶切驗證及測序，最終獲得正確質粒。

含不同靶標位點gRNA序列的質粒pXMJ19-rACU-gRNATS，均由質粒pXMJ19-rACU -gRNA：：ccdBTS通過Golden Gate方法構建，具體方法可參見文獻［8］。

1.2.3 谷氨酸棒桿菌的轉化 將在BHI培養基中過夜培養的C. glutamicumATCC 13032菌液以初始OD6000.3轉接到含INH、Tween80、DL-蘇氨酸和葡萄糖的NCM培養基中。當OD600=1時，制備C.glutamicumATCC 13032感受態細胞感受態，具體方法參見文獻報道［11］。

雙質粒轉化：取 2 μg pXMJ19-rACTS質粒或pXMJ19-rACUTS質粒和 1 μg pTrcmob-gRNA 加入到80 μLC. glutamicumATCC 13032感受態細胞中，1.8kV電轉后立即加入1 mL 提前預熱的BHIS培養基，放至金屬浴鍋46℃溫浴6 min。搖床30℃培養2 h后，涂布于含15 μg/mL Kan和5 μg/mL Cm抗性的LBHIS固體培養基平板上，30℃靜置培養2-3 d，直至長出單菌落。

單質粒轉化：取1 μg pXMJ19-rACU-gRNATS質粒到80 μLC. glutamicumATCC 13032感受態細胞中，轉化方法同雙質粒，30℃后培養1 h后，涂布于含5 μg/mL Cm抗性的LBHIS固體培養基平板上。

1.2.4 谷氨酸棒桿菌的培養及堿基編輯 種子培養：挑取生長良好的單菌落接種于裝有3 mL LBHIS液體培養基（含15 μg/mL Kan和5 μg/mL Cm）的15 mL試管中，30℃，220 r/min培養24 h。誘導培養：將種子培養液按初始OD6000.2的接種量轉接于裝有3 mL的LBHIS液體培養基（含1 mmol/L IPTG，15μg/mL Kan和5 μg/mL Cm）的15 mL試管中，30℃，220 r/min培養20 h。1.2.5 質粒去除及堿基編輯比例分析 將誘導編輯后的菌液，4 500 r/min、4℃條件下離心5 min，收集菌體，將上清去除后，用生理鹽水（0.9% NaCl）將菌體洗兩次，去除殘留的IPTG，然后用等體積的生理鹽水重懸菌體；按初始OD6000.01的接種量轉接至不含抗性的LBHIS液體培養基中，37℃，220 r/min培養24 h；將菌液劃線到無抗的LBHIS固體平板上，37℃靜置培養2-3 d，直至長出單菌落；針對不同的靶標位點，隨機各自挑取10個單菌落，用各自引物（距離靶標位點上下游200 bp處設計引物）和2×Es Taq Master Mix（Dye）進行菌落PCR，將PCR產物送Sanger測序。借助SnapGene軟件分析Sanger測序峰圖結果，并通過DNAMAN軟件進行多序列比對分析，將編輯后單菌落測序結果與原始序列比對，匯總整理編輯效率、編輯位點及比例。

2 結果

2.1 基于rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白的堿基編輯器的構建與測試

為了測試rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白是否可以實現在谷氨酸棒桿菌中的高效編輯，我們以改造過的溫敏型質粒pXMJ19TS作為框架，選用IPTG誘導型啟動子tac，將經過谷氨酸棒桿菌密碼子優化后的rAPOBEC1融合在nCas9（D10A）蛋白的N端，并在中間添加XTEN連接肽，獲得重組質粒pXMJ19-rACTS（圖1-A）。選取調控因子Cgl0016及Cgl0170作為兩個靶標基因，將實驗室前期已構建且含該兩個靶標基因gRNA序列的質粒pTrcmob-gRNANoPer，分別與pXMJ19-rACTS共轉化至C. glutamicumATCC 13032中。經過誘導編輯以及Sanger測序分析，如圖1-B所示，兩個位點均發生了編輯，但只有Cgl0170出現C到T的編輯，編輯比例僅為20%，而且兩個位點均出現C到A或C到G的編輯，編輯產物純度不高，推測原因可能為胞內的尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA glycosylase，UDG）能夠將中間產物U切除，形成無嘧啶位點，經過跨損傷合成聚合酶作用及DNA復制等，以一定幾率將C堿基轉換為其他堿基［12］。

2.2 融合UGI蛋白，構建并測試BE3堿基編輯器

在之前的研究報道中，尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白UGI的添加能夠有效抑制體內的DNA堿基切除修復機制，防止胞嘧啶核苷脫氨轉化生成的尿嘧啶核苷被切除，從而提高C到T的轉化效率，并且對提高編輯產物純度也有重要作用［12］。為提高堿基編輯器的編輯效率，我們在上述rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白基礎上，在其C端進一步融合谷氨酸棒桿菌密碼子優化后的UGI蛋白，獲得BE3型胞嘧啶堿基編輯器（rAPOBEC1-XTEN-nCas9（D10A）-UGI），并將構建的質粒命名為pXMJ19-rACUTS（圖2-A）。經過對靶標基因Cgl0016及Cgl0170的誘導編輯以及Sanger測序分析，相比較于rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白，添加UGI后，兩個位點的編輯效率均得到明顯提高（圖2-B）。其中，Cgl0016中C到T的編輯比例由原來的未編輯提高到高達90%，Cgl0170中C到T的編輯比例也由20%提高到70%，并且兩個位點的編輯中均未再出現C到A，C到G的編輯，編輯產物純度提高。

圖1 質粒pXMJ19-rACTS的構建及堿基編輯結果

圖2 質粒pXMJ19-rACUTS的構建及堿基編輯結果

2.3 優化雙質粒編輯系統為單質粒編輯系統

依賴雙質粒的堿基編輯系統，在谷氨酸棒桿菌轉化環節以及丟失質粒環節，效率較低、操作繁瑣，不利于以后高通量自動化的改造菌株。因此，為了簡化操作，本研究在pXMJ19-rACUTS質粒基礎上，加入gRNA轉錄模塊，獲得重組質粒pXMJ19-rACU-gRNATS（圖3-A）。在gRNA模塊中插入ccdB反選標簽，通過Golden Gate的連接方法即可快速實現靶標gRNA序列的替換。相比較于雙質粒的轉化，單質粒的轉化效率得到明顯提高（圖4）。為了研究調整為單質粒結構后，編輯效率以及編輯窗口是否會受到影響，分別構建了含Cgl0016及Cgl0170的靶標gRNA序列的單質粒編輯系統。經過誘導編輯及Sanger測序，兩個位點均得到編輯，且編輯窗口未發生改變（圖3-B），雖然從測序峰圖及編輯比例來比較，單質粒的編輯效率出現略微的下降，但編輯效率仍然較高，其中，Cgl0016中C到T的編輯比例為80%，Cgl0170中C到T的編輯比例為60%，并且均未有C到A，C到G的編輯。該實驗結果證明，單質粒編輯系統可以取代雙質粒編輯系統，應用于后期的研究中。

2.4 基因組中其他位點的堿基編輯測試

為了進一步驗證BE3型胞嘧啶堿基編輯器在谷氨酸棒桿菌的編輯效率，并測試該堿基編輯器編輯框的范圍，我們另選取了基因組中其他4個位點（Cgl0106，Cgl1492，Cgl0221，Cgl2111）進行測試。通過分別構建含靶標gRNA序列的單質粒編輯系統、誘導編輯以及Sanger測序分析，發現4個位點同樣可以實現C到T的編輯（圖5），除Cgl0106位點編輯效率為40%外，其他3個位點的編輯效率均高達90%-100%，充分證明了該堿基編輯器的高效性。另外還發現，該堿基編輯器的編輯框可以覆蓋PAM上游-11至-19位，相比較于哺乳動物中的編輯框（PAM上游-13到-17位），范圍更大，該特性推測可能是由于物種差異所造成。編輯框的擴展，將覆蓋更多的基因組靶標位點，在全基因組失活基因應用中，具有較明顯的優勢。

圖3 質粒pXMJ19-rACU-gRNATS的構建及堿基編輯結果

圖5 谷氨酸棒桿菌基因組位點堿基編輯結果

3 討論

谷氨酸棒桿菌是從土壤中分離出來的革蘭氏陽性菌，為食品安全性菌株，在工業生產領域廣泛的應用于生產各類氨基酸、有機酸等大宗化學品。近年來，隨著CRISPR/Cas系統的發展與壯大，科研人員已成功在谷氨酸棒桿菌中建立了基于DSB的CRISPR/Cas9或Cpf1基因組編輯工具，為谷氨酸棒桿菌的基因組改造提供了強大的技術支持［13-14］。但是由于DSB帶來的毒性、對外源模板DNA的需求，以及谷氨酸棒桿菌自身基因組的穩定導致的同源重組效率低，這些因素限制了CRISPR/Cas系統在谷氨酸棒桿菌中的應用，對于自動化高通量的基因組改造、多位點編輯等仍然存在較大難度。堿基編輯技術的興起，為解決上述問題提供了新的研究思路。該技術結合了CRISPR/Cas系統的靶向特異性與堿基脫氨酶的催化活性，可在不產生DSB、不依賴宿主的同源重組修復且不需要外源DNA模板的情況下對基因組上位點實現高效精準的編輯，并且避免了DSB造成的靶標或非靶標序列的缺失、插入等突變。

BE3型堿基編輯器與前期已開發的堿基編輯技術MACBETH相比，主要存在以下幾點不同：（1）編輯窗口不同，MACBETH編輯窗口為PAM上游-16到-20位，而BE3的編輯窗口覆蓋范圍較寬，為PAM上游-11到-19位；（2）編輯效率存在差異，MACBETH技術在不添加UGI蛋白的情況下，編輯效率即可達到較高，C到T的堿基編輯效率高達90%-100%，而BE3型堿基編輯器在不添加UGI蛋白時，編輯效率較低，UGI蛋白的添加能顯著提高堿基編輯效率，使得C到T的堿基編輯效率同樣高達90%-100%。BE3型堿基編輯器的開發能夠很好的與MACBETH互補，有助于覆蓋更多的基因組靶標位點，為自動化高通量的基因組改造提供更多的選擇，從而加速谷氨酸棒桿菌的基礎與應用研究。

4 結論

本研究首先融合表達rAPOBEC1-nCas9（D10A）蛋白，實現在谷氨酸棒桿菌中C到T的編輯，編輯比例較低（0-20%）。添加UGI蛋白后，顯著提高了堿基編輯效率，使得C到T的堿基編輯效率高達90%。為了簡化操作，將雙質粒堿基編輯系統優化為單質粒堿基編輯系統，并且未明顯影響堿基編輯效率及編輯窗口。最后對基因組中其他位點進行測試，證明編輯框為PAM上游-11到-19位，編輯效率為40%-100%。