利用CRISPR/Cas9技術構建大鼠L2細胞α-ENaC基因敲除穩定細胞株

王松 李鵬程 白朝輝 許宏鑫 應研敏 張墨 白義春

（1. 新鄉醫學院公共衛生學院，新鄉 453000；2. 西北農林科技大學動物科技學院，楊凌712100；3. 新鄉醫學院全過程教學基地，新鄉 453000；4. 新鄉醫學院第一臨床學院，新鄉 453000；5. 新鄉醫學院法醫學院，新鄉 453000）

上皮鈉通道（Epithelial sodium channel，ENaC）是阿米洛利敏感性鈉離子通道［1］，廣泛分布于肺泡上皮細胞中，其主要功能是將Na+從頂膜攝入到極化的上皮細胞［2］，該過程伴隨著水和 Cl-的重吸收［3］，在肺泡腔水腫液清除（Alveolar fluid clearance，AFC）中起重要作用［4-5］。其中α亞基是ENaC的功能亞基，全身性敲除α-ENaC基因的小鼠因不能有效清除肺內羊水而在出生40 h內死亡［6］。對出生1 h的小鼠通過siRNA干擾α-ENaC基因的表達，肺泡腔水腫液顯著增加，同時小鼠的死亡率增加了4倍［7］。人的α-ENaC基因的某些堿基的突變，會導致肺泡腔液體不能有效清除而引起呼吸窘迫綜合征［8］。因此，肺泡α-ENaC蛋白的功能狀態對肺水清除有重要的影響。

近年來人們在HepG2細胞、神經干細胞中研究還發現，α-ENaC蛋白還可能通過調控Na+流對細胞增殖產生影響［9-10］。同時α-ENaC蛋白還與雄性生殖系統有密切的聯系，可能參與精子活力的調控［11］。因此α-ENaC蛋白具有許多重要的生理功能。大鼠肺的α-ENaC蛋白主要分布于I型和II型肺泡上皮細胞［12］。II型肺泡上皮細胞是肺泡上皮細胞的干細胞［13］，在肺損傷時增生轉化為I型肺泡上皮細胞［14］。因此研究α-ENaC蛋白在II型肺泡上皮細胞中的作用具有重要的意義。但是原代分離的II型肺泡上皮細胞，在體外培養時，隨著時間的推移，會逐漸分化為I型肺泡上皮細胞，而失去II型肺泡上皮細胞的一些生物學活性。L2細胞保留了大鼠II型肺泡上皮細胞的主要特征，是大鼠II型肺泡上皮細胞系。本實驗利用CRISPR/Cas9技術構建敲除L2細胞α-ENaC基因的細胞株，這將為研究α-ENaC蛋白在II型肺泡上皮細胞中的生物學功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

CRISPR/Cas9骨架載體pll3.7-mU6-CMV-NLS-huCAS9-NLS（Cas9-Wild）、 擴 增 導 向 RNA（guide RNA，gRNA）的載體JMB81-SP1.gRNA.opti和SSARPG報告載體骨架均來自西北農林科技大學動物科技學院張智英老師實驗室［15-16］；L2細胞（大鼠II型肺泡上皮細胞）購自美國ATCC；限制性內切酶購自美國NEB；Protein ladder（美國Thermo Fisher Scientific，26617）；DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司，BM121）；質粒提取試劑盒（美國Omega，D6943-01*）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國Omega，D2500-01）；pMDTM19-T 載體克隆試劑盒（日本TaKaRa，6013）；胎牛血清（以色列BI，04-001-1ACS）；F-12K培養基（美國ATCC，30-2004）；兔 源 SCNN1A（α-ENaC） 抗 體（ 美 國 Affinity，DF9199）；辣根酶標記的羊抗兔IgG抗體（美國Affinity，S0001）；鼠源β-actin抗體（美國BOSTER，BM0627）和辣根酶標記的羊抗鼠IgG抗體（美國Biolegend，405306，）；Lipofectamine?2000 轉染試劑（美國 Thermo Fisher Scientific，11668-019）；CCK-8試劑盒（中國US EVERBRIGHT INC，C6005）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9表達載體的構建 利用在線分析軟件（http：//benchling.com），在α-ENaC基因的第一外顯子選擇3個靶位點：GCATGGGCTGAGGAGGACAAGGG，CAACAACACCACCATCCACGGGG和TGTCCTCCTCAGCCCATGCAAGG。3個靶位點的位置如圖1所示。上游引物分別為gRNA-α-ENaC-F1，gRNA-α-ENaC-F2 和 gRNA-α-ENaC-F3，下游引物同為gRNA-α-ENaC-R，引物序列見表1。以JMB81-SP1.gRNA.opti為模板，利用TouchDown程序PCR擴 增 gRNA-α-ENaC。 將 gRNA-α-ENaC用BsaΙ和XhoΙ雙酶切插入到BamHΙ和XhoΙ雙酶切后的Cas9-Wild骨架中，得到靶向α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表達載體α-ENaC.CRISPR/Cas9。

1.2.2 SSA-RPG報告載體的構建 SSA-RPG報告載體骨架示意圖如圖2所示。載體中含有一個發紅光的DsRed基因，用于反應轉染效率。CAG啟動子啟動通過剪切肽T2A融合的PuroR和eGFP基因，PuroR基因中間插入靶位點而被打斷，靶位點兩側是重復序列，因此PuroR和eGFP不表達（圖2-A），當靶位點被切割后，PuroR通過細胞內源的單鏈退火（Single-strand anealing，SSA）修復機制，恢復表達，eGFP隨之表達，細胞表現出Puro抗性并發出綠色熒光（圖2-B），因此綠色熒光可以反應核酸酶的切割活性。

圖1 α-ENaC基因3個靶位點位置

表1 構建載體所需引物序列

圖2 SSA-RPG報告載體示意圖

構建3組報告載體的靶點引物分別為：targetα-ENaC-F1 和 target-α-ENaC-R1 ；target-α-ENaC-F2和 target-α-ENaC-R2 ；target-α-ENaC-F3 和 target-α-ENaC-R3，引物序列見表1。為了便于檢測，在靶位點前面插入XhoΙ酶切位點。將target-α-ENaC-F/target-α-ENaC-R 引 物 擬 合 后， 插 入 到NotΙ 和BamHΙ雙酶切后的SSA-RPG報告載體骨架中，獲得α-ENaC基因的報告載體α-ENaC.SSA-RPG。

1.2.3 HEK293T細胞轉染及CRISPR/Cas9表達載體的活性檢測 HEK293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，細胞密度達到80%時，利用Lipofectamine?2000進行轉染。轉染3組，轉染質粒分別為 ：α-ENaC.CRISPR/Cas9-1+α-ENaC.SSARPG-1，α-ENaC.CRISPR/Cas9-2+α-ENaC.SSA-RPG-2，α-ENaC.CRISPR/Cas9-3 +α-ENaC.SSA-RPG-3。48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達，并用流式細胞儀對DsRed+和GFP+陽性細胞進行計數。DsRed+代表被轉染的細胞，DsRed+GFP+代表CRISPR/Cas9表達載體有活性的細胞，因此DsRed+GFP+/DsRed+代表CRISPR/Cas9表達載體活性的大小。

1.2.4 L2細胞轉染 L2細胞用含10% FBS的F-12K培養基培養，轉染條件同HEK293T細胞。轉染兩組質粒，對照組質粒Cas9-wild+α-ENaC.SSA-RPG-3和以上篩選出的CRISPR/Cas9活性較高的實驗組質粒α-ENaC.CRISPR/Cas9-3+α-ENaC.SSA-RPG-3。

1.2.5 嘌呤霉素篩選 L2細胞轉染48 h后，細胞中加入終濃度為3 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選，每天換液，連續篩選5 d，將細胞移入10 cm的培養皿中，撤去嘌呤霉素繼續培養至長出單克隆。

1.2.6 Western Blot檢測 將單克隆細胞擴大培養后，裂解液4℃裂解，12 000 r/min離心，提取總蛋白，用Bradford法測量蛋白濃度。變性后的蛋白樣本等質量上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳（80 V，30min；120 V，50 min），用孔徑 0.45 μm 的 PVDF膜進行轉膜（300 mA，90 min），5%脫脂牛奶封閉30 min后，分別用稀釋好的α-ENaC抗體和β-actin抗體4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次/10 min，再加入相應的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體室溫搖床孵育1 h，TBST洗3次后，ECL化學發光法顯影，凝膠成像系統曝光并分析結果。

1.2.7 突變結果檢測 將α-ENaC蛋白表達量下降或無蛋白表達的單克隆細胞用SDS堿裂解法提取基因組DNA，以該基因組DNA為模板，分別 以 F1：CCCCATTCTGCCTTCACGCTA，R1：TCCTCGAACAGCAAGGCGAAC為上下游引物，PCR擴增靶位點附近的DNA片段進行測序，并將測序峰圖為雜峰的PCR產物連接到pMDTM19-T載體上，進一步測序檢測。

1.2.8 脫靶檢測 為了檢測該CRISPR/Cas9系統的脫靶效應，考慮到脫靶現象的位置效應結合α-ENaC基因的特點，挑選α-ENaC基因高度同源的亞單位β-ENaC基因和γ-ENaC基因4個潛在的脫靶位點，分別為：AGGGCCCAGGCTACACCTACAAGG，T C T C C C C A C T T A G G T A C T C C A A G G，T C C A T G C C G T C C A C C T T G G A A G G 和CTTTTCCACCATCCAATGTATGG。以野生型和3個突變克隆基因組混池為模板，進行PCR擴增，通過峰圖確定脫靶效應。PCR擴增引物如表2所示。

1.2.9 細胞增殖試驗 將各組細胞分別以2×103接種至96孔板，分別于貼壁后0、24、48、72 h加入10 μL CCK-8 試劑，繼續培養 1 h（37℃，5% CO2），酶標儀測定450 nm處吸光度。每組5個復孔，實驗重復3次。

1.2.10 統計學分析 使用SPSS 24.0軟件進行數據分析，數據以x-±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRISPR/Cas9表達載體和SSA-RPG報告載體的構建

將構建的CRISPR/Cas9表達載體α-ENaC.CRISPR/Cas9和SSA-RPG報告載體α-ENaC.SSARPG進行測序，測序結果顯示靶向α-ENaC基因的gRNA已經插入到CRISPR/Cas9表達載體，靶位點序列已經插入到SSA-RPG報告載體，測序結果見圖3。

表2 擴增潛在脫靶位點所需引物序列

圖3 α-ENaC.CRISPR/Cas9和α-ENaC.SSA-RPG報告載體的測序圖

2.2 三組CRISPR/Cas9表達載體在HEK293T細胞的活性檢測

為了驗證3組CRISPR/Cas9 表達載體的活性大小，在HEK293T 細胞中對3組CRISPR/Cas9 表達載體利用SSA-RPG報告載體進行了活性檢測。將3組α-ENaC.CRISPR/Cas9和α-ENaC.SSA-RPG 報告載體分別共轉染HEK293T細胞，轉染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察熒光，同時用流式細胞儀對DsRed+GFP+和DsRed+細胞進行計數。結果顯示轉染48 h 后，a、b、c三組細胞都既發紅色熒光又發綠色熒光（圖4-A），流式細胞儀檢測c組的DsRed+GFP+/DsRed+的比率較高（圖4-B），說明該組中α-ENaC.CRISPR/Cas9-3相比其他兩組表達載體效率更高。因此后續的L2細胞的α-ENaC基因的敲除實驗我們采用α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達載體。

2.3 α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達載體在L2細胞的活性檢測

為了檢測構建的α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達載體在L2細胞是否具有活性，將α-ENaC.CRISPR/Cas9-3和α-ENaC.SSA-RPG-3共轉染L2細胞，將野生型的Cas9-Wild和α-ENaC.SSA-RPG-3共轉染作為對照，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞（圖5）。從圖中可以看出，轉染48 h后，對照組細胞只發紅光不發綠光，而實驗組細胞既發紅光又發綠光，說明構建的α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達載體具有活性，在報告載體水平可以有效的切割靶位點。

2.4 蛋白檢測

挑取嘌呤霉素篩選后的8個單克隆細胞株進行蛋白水平的檢測，克隆4#和7#細胞株中α-ENaC蛋白表達量顯著下降，克隆8#細胞株α-ENaC蛋白完全沒有表達（圖6）。

2.5 基因序列突變檢測

提取單克隆的4#、7#和8#的基因組DNA，并PCR擴增靶位點附近序列，測序結果顯示為雜峰，進一步將PCR產物克隆到pMDTM19-T載體中進行測序，測序結果顯示，克隆4#和7#中細胞均為單等位基因突變，分別缺失4 bp和2 bp且都是移碼突變，克隆8#為雙等位基因突變，分別為插入1 bp的移碼突變和186 bp的大片段缺失（圖7）。

圖4 HEK293T細胞轉染48 h的CRISPR/Cas9系統活性檢測

圖5 L2細胞轉染48 h的CRISPR/Cas9系統活性檢測

圖6 Western Blotting檢測α-ENaC蛋白表達

2.6 脫靶檢測

為了檢測該CRISPR/Cas9系統的脫靶效應，選擇了4個潛在的脫靶位點，PCR擴增后測序，通過峰圖確定脫靶效應，結果（圖8）顯示4個PCR產物測序結果都為單峰，并與NCBI公布的序列結果一致，說明4個潛在的脫靶位點沒有發生脫靶現象。

圖7 突變株靶位點的測序結果

圖8 潛在脫靶位點的測序結果

2.7 細胞增殖試驗

為了探討α-ENaC蛋白的表達對L2細胞株增殖的影響，采用CCK-8對細胞增殖活力進行了測定。結果（圖9）顯示，同一時點，α-ENaC基因敲除的細胞株增殖活力較野生型細胞均顯著降低（P＜0.01），48 h和72 h時，雙等位基因突變株增殖活力下降較單等位基因突變株更為顯著（P＜0.01）。

圖9 細胞增殖試驗（*P＜0.01）

3 討論

α-ENaC蛋白是ENaC通道的功能亞基，其主要功能是調節極化上皮細胞的水鹽平衡，在肺水腫液的清除過程中必不可少［17］；此外，α-ENaC蛋白還可能參與精子活力的調控［11］。研究發現，α-ENaC蛋白在HepG2細胞和神經干細胞中，還可能通過調控Na+電流對細胞增殖產生影響［9-10］，因此推測α-ENaC蛋白可能與肺泡上皮細胞的增殖有關。由于α-ENaC基因敲除的小鼠出生后肺內羊水不能及時排出，最多只能存活40 h［6］，該模型不能對α-ENaC蛋白的功能做進一步的研究。II型肺泡上皮細胞是肺泡上皮細胞的干細胞［13］，其增殖能力在肺損傷修復時具有重要的功能。因此，研究α-ENaC蛋白在II型肺泡上皮細胞中的功能具有重要的意義。本實驗利用CRISPR/Cas9系統結合SSA-RPG報告載體篩選系統，成功構建α-ENaC基因敲除的細胞株。

CRISPR/Cas9系統是近年來發展起來的基因編輯系統，因其成本低、構建簡單、打靶效率高受到了科研工作者的青睞，在許多物種及細胞上都有應用。但是關于在大鼠II型肺泡上皮細胞上的應用，還未見報道。SSA-RPG報告載體是一種富集基因編輯的陽性細胞的篩選報告系統［16］，已應用于人、小鼠、雞、豬等多種細胞［16，18-20］。該系統不僅可以通過嘌呤霉素或流式細胞儀對基因編輯的陽性細胞進行富集，還可以通過轉染后48 h的熒光來檢測CRISPR/Cas9系統的活性。實驗中我們選取了靶向大鼠L2細胞α-ENaC基因的3個靶位點，分別構建了3組CRISPR/Cas9表達載體和相應的SSA-RPG報告載體。但是由于大鼠L2細胞的轉染效率較低，因此我們首先在HKE293T上首先進行了CRISPR/Cas9系統活性的檢測，確定以切割活性較大的α-ENaC.CRISPR/Cas9-3表達載體在L2細胞中進行實驗，獲得2株單等位基因突變細胞株和一株雙等位基因突變細胞株，這些突變造成移碼突變或是大片段的缺失。CRISPR/Cas9系統雖然當前在動植物中得到了廣泛的應用，但是脫靶效應一直是CRISPR/Cas9系統困擾科研工作者的一個重要的問題。大鼠ENaC家族由α、β和γ族3個高度同源的亞單位組成［21］，因此我們根據CRISPR/Cas9系統的作用機理，同時結合α-ENaC基因的特點，選擇含有NGG序列的潛在的脫靶位點檢測，沒有檢測到脫靶現象，下一步我們將通過全基因組測序對脫靶問題做進一步分析。對敲除細胞株進行Western Blot檢測，結果顯示單等位基因突變細胞株蛋白表達明顯降低，而雙等位基因突變細胞株蛋白完全沒有表達，因此我們成功構建了α-ENaC基因敲除的大鼠L2細胞株。對α-ENaC基因敲除前后的細胞進行細胞增殖活力檢測結果發現，α-ENaC基因敲除后，L2細胞的增殖活力顯著降低，證明α-ENaC蛋白表達與細胞增殖有關，這與之前的相關報道一致［9-10］。由此可見，α-ENaC蛋白表達對Ⅱ型肺泡上皮細胞的增殖具有重要意義。因此，α-ENaC基因敲除細胞株的構建，為進一步闡明α-ENaC對L2細胞增殖的調控機制及其它功能奠定了基礎。

4 結論

CRISPR/Cas9技術結合SSA-RPG報告載體系統靶向敲除L2細胞α-ENaC基因，通過嘌呤霉素篩選獲得基因敲除的細胞株。對基因敲除細胞株進行細胞增殖試驗表明，基因敲除細胞株的增殖活力顯著降低，其中雙等位基因突變的細胞株增殖活力下降更為顯著。

致謝

感謝吉宏龍教授在本實驗和論文修改中給予的建議。