油橄欖葉多酚的酶法提取及穩定性研究

清源 ，趙燕 ，張萬明*

(1.西昌學院 農業科學學院，四川 西昌 615013；2.德昌鴻源農林科技發展有限公司，四川 德昌 615500)

油橄欖(Oleaeuropaea)又名齊墩果，是世界著名的木本油料樹種，現已廣泛種植于我國四川、甘肅等地[1]。葉片是油橄欖產業發展過程中的主要副產物，一般被廢棄，但因其富含多酚類物質，可被功能食品、現代醫藥和保健行業所利用[2-4]。現有研究如芒果皮多酚用于食品保鮮，香蕉皮多酚用于食品輔色、調味、酒水的澄清，迷迭香多酚抑制食源性致病菌李斯特菌，甘蔗皮原花青素的提取及抗氧化活性研究等，均展示出植物多酚的重要應用價值[5-8]。因此，開展以橄欖葉為原料提取多酚的研究并應用于食品、化妝品等行業，不僅能有效減少橄欖葉的環境污染問題，還能延長油橄欖產業發展的鏈條，更好地創造經濟效益。

目前，多酚提取工藝主要有溶劑提取法、微波和超聲波輔助法等，而利用生物酶提取多酚的方法具有成本低、使用方便、反應條件溫和、綠色環保等優點，非常適合于工業化生產[9]。目前關于橄欖葉多酚的酶法提取研究還較少，值得探討。此外，目前關于油橄欖葉中多酚類物質穩定性的研究報道也較少，而多酚穩定性是人們在加工利用過程中必須考慮的問題，因此本文還探討了食品添加劑對油橄欖葉多酚的加工穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖葉(品種為“配多靈”)， 2018年3月采自德昌鴻源農林科技發展有限公司橄欖基地，粉碎后過80目篩備用；ULUP-IV-10T型優普系列超純水。

果膠酶(40 U/mg)、纖維素酶(3 U/mg)、中性蛋白酶(60 U/mg)、木瓜蛋白酶(100 U/mg)：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸、碳酸鈉、福林-酚試劑等：均為分析純；葡萄糖、蔗糖、阿斯巴甜、木糖醇、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、亞硫酸鈉和過氧化氫：均為食品級。

1.2 儀器與設備

PHS-3C 型pH計 上海精密儀器儀表有限公司；ME204 型分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HW.SY21-K4C 型水浴恒溫振蕩器 北京市長鳳儀器儀表公司；純水機。

1.3 方法

1.3.1 多酚提取工藝

油橄欖葉粉→加蒸餾水→調pH→酶解→沸水滅酶→冷卻→真空抽濾→濾液→沉淀物二次提取→合并兩次濾液→定容→粗多酚提取液→多酚得率測定。

1.3.2 酶復配比例的篩選

精密稱取4份油橄欖葉粉2.0 g，置于100 mL三角瓶中，分別加入4.0%(按橄欖葉粉質量)的纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶的復配酶，在酶解溫度為45 ℃、料液比1∶40(g/mL)、pH 6.0條件下，酶解30 min，以粗多酚得率為指標，以不加酶的樣品作為對照，優選最佳的酶配比進行后續試驗。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 酶解時間對多酚得率的影響

設定復配酶用量為4.0%，酶解溫度45 ℃，酶解 pH 值 6.0，料液比 1∶40(g/mL)，探討酶解時間分別為30，40，50，60，70 min時對油橄欖葉粗多酚得率的影響。

1.3.3.2 酶解溫度對多酚得率的影響

設定復配酶用量為4.0%，酶解時間40 min，酶解 pH 值 6.0，料液比 1∶40(g/mL)，探討酶解溫度分別為 40，45，50，55，60 ℃時對油橄欖葉粗多酚得率的影響。

1.3.3.3 酶解pH值對多酚得率的影響

設定復配酶用量為4.0%，酶解時間40 min，酶解溫度 50 ℃，料液比 1∶40(g/mL)，探討酶解 pH 值分別為 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0時對油橄欖葉粗多酚得率的影響。

1.3.3.4 酶用量對多酚得率的影響

設定酶解時間為40 min，酶解溫度50 ℃，酶解 pH 值 6.0，料液比 1∶40(g/mL)，探討復配酶用量分別為 1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%時對油橄欖葉粗多酚得率的影響。

1.3.3.5 料液比對多酚得率的影響

設定復配酶用量為5.0%，酶解時間40min，酶解溫度 50 ℃，酶解 pH值6.0，探討料液比1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)時對油橄欖葉粗多酚得率的影響。

1.3.4 均勻試驗設計

根據單因素試驗結果，按照 U10(108)進行均勻設計試驗，得出油橄欖葉粗多酚的最佳酶解工藝。

1.3.5 油橄欖葉粗多酚得率的計算

采用福林酚法測定總酚。

1.3.5.1 沒食子酸標準曲線的繪制

以標準沒食子酸溶液濃度(mg/mL)為橫坐標X，吸光值Y為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=11.418X+0.0233，R2=0.9966。

1.3.5.2 粗多酚得率的計算

式中：B為油橄欖葉粗多酚得率，%；Y為多酚提取液濃度，mg/mL；V為多酚提取液體積，mL；n為稀釋倍數；M為橄欖葉質量，g。

1.3.6 食品添加劑對油橄欖葉粗多酚加工穩定性的影響

1.3.6.1 甜味劑

在最佳提取條件下，用油橄欖葉粗多酚提取液將葡萄糖、蔗糖、木糖醇和阿斯巴甜配成濃度為0，2.5，5，10，20，50 mg/mL的溶液，搖勻，靜置后測定粗多酚含量。

1.3.6.2 防腐劑

在最佳提取條件下，用油橄欖葉粗多酚提取液將山梨酸鉀和苯甲酸鈉配成濃度為0，0.5，1，5，10，15 mg/mL的溶液，搖勻，靜置后測定粗多酚含量。

1.3.6.3 還原劑

在最佳提取條件下，用油橄欖葉粗多酚提取液將Na2SO3配成濃度為0，5，10，15，20 mg/mL的溶液，搖勻，靜置后測定粗多酚含量。

1.3.6.4 氧化劑

在最佳提取條件下，用油橄欖葉粗多酚提取液將H2O2配成濃度為0，7.5，15，22.5 mg/mL的溶液，搖勻，靜置后測定粗多酚含量。

1.3.7 試驗結果統計與分析

運用Excel和DPS軟件對試驗結果進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 酶的復配比例篩選結果

圖1 酶復配比例的篩選結果Fig.1 Screening results for compoundingproportions of enzymes

由圖1可知，與無酶處理(對照)相比，4種酶配比均有不同程度提高橄欖葉多酚得率的作用。其中，纖維素酶∶果膠酶∶中性蛋白酶為1∶1∶2時多酚得率為1.58%且效果較其他3種更優，故選擇該復配比例作為油橄欖葉粗多酚的后續提取。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解時間對粗多酚得率的影響

圖2 酶解時間對多酚得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of polyphenols

由圖2可知，30～40 min內油橄欖葉多酚的得率隨著時間的延長迅速增大，可能是因為開始時底物濃度相對較高，酶解破壞細胞結構，有利于傳質過程的發生[10]。40 min時得率達最大值，隨時間延長，提取得率反而略有下降，長的處理時間易引起多酚物質的氧化分解，使提取量降低。

2.2.2 酶解溫度對粗多酚得率的影響

圖3 酶解溫度對多酚得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on theyield of polyphenols

由圖3可知，40～50 ℃ 時，油橄欖葉多酚得率隨著溫度的升高而增加，在 50 ℃處達到最大。之后即使升高溫度，提取效率也不再增加，反而下降。當溫度較低時，無法達到反應所需的活化能，因而反應速度較慢，多酚得率也較低；但是，當溫度較高時，酶活性逐漸喪失，反應速率減慢，多酚得率也降低[11]。

2.2.3 酶解pH值對粗多酚得率的影響

圖4 酶解pH值對多酚得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the yield of polyphenols

由圖4可知，油橄欖葉多酚得率隨 pH 的增大而增加，當 pH 值為 6.0 時多酚得率達到最高，之后開始降低。當pH 較低時，中性蛋白酶的活性受到抑制；當 pH>6.0 時，纖維素酶、果膠酶的活性受到抑制[12]。而且多酚類物質在堿性條件下不穩定，也是導致多酚含量下降的原因之一。因此，最適 pH 值為 6.0，中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的活性均達到最大。

2.2.4 酶用量對粗多酚得率的影響

圖5 酶用量對多酚得率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the yield of polyphenols

由圖5 可知，油橄欖葉多酚的得率隨酶用量的增加而增加，纖維素酶和果膠酶協同作用能有效破壞植物細胞壁與細胞間質，使胞內的物質快速溶出；中性蛋白酶能較好地破壞蛋白質等大分子物質，促進多酚更好地溶出[13]。當酶用量為5.0%時，油橄欖葉多酚得率達到最大。

2.2.5 料液比對粗多酚得率的影響

圖6 料液比對多酚得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols

由圖6可知，油橄欖葉多酚的得率隨料液比的增加呈上升的趨勢，在 1∶60(g/mL)處達到最大值。當料液比較小時，不利于傳質，短時間內多酚的浸出受到抑制，所以得率較低；而料液比較大時，水分的增加又使酶的濃度降低，酶與底物的接觸幾率下降，多酚得率也會降低[14]。

2.3 均勻試驗結果

2.3.1 均勻設計

根據單因素試驗結果，選擇酶解時間、酶解溫度、pH 值、酶用量和料液比 5個因素的較優水平，按照 U10(108)設計進行均勻試驗，因素與水平表見表1。

表1 均勻試驗設計因素與水平表Table 1 Factors and levels of uniform experimental design

2.3.2 均勻試驗結果與分析

按照優化之后的方法，每次提取油橄欖葉粉2.0 g，根據選定的均勻設計表，得出試驗結果，見表2。

表2 均勻試驗結果Table 2 The results of uniform experiment

運用DPS軟件進行二次多項式回歸分析，得到回歸方程為：Y=3.6685-0.9478X4+0.0102X5+0.0004X22+0.0873X42-0.0014X2X3-0.0019X2X4-0.0020X3X5+0.0016X4X5。對建立的模型進行檢驗可知，P=0.0057<0.01，說明結果極顯著。負相關系數 R=0.99997，說明該模型與實際試驗擬合度高，能很好地擬合復合酶法提取橄欖葉多酚的工藝條件，方程有意義。

對相關系數進行檢驗，結果見表 3。其中，X22的交互項系數達到極顯著水平(P<0.01)，X4、X5的回歸系數和X42、X2X3、X2X4、X3X5、X4X5的交互項系數均達到了顯著水平(P<0.05)，具有顯著的統計學意義。表明油橄欖葉多酚得率與各因素間并非簡單的線性關系，而是存在交互作用。由P值的大小可知，對油橄欖葉多酚得率影響的大小順序為：X22>X42>X4>X3X5>X2X3>X4X5>X5>X2X4。

表3 相關系數及檢驗結果 Table 3 Correlation coefficients and test results

分析得到復合酶法提取油橄欖葉粗多酚的理論得率是2.67%，最優提取條件為：酶解時間39.96 min，酶解溫度 71.96 ℃，pH 值4.23，酶用量7.06%，料液比 1∶52.21(g/mL)。

2.3.3 最佳工藝的確定及驗證

為操作方便，設置最佳提取工藝條件為：酶解時間40 min，酶解溫度 72 ℃，pH 值4.2，酶用量7.1%，料液比 1∶52(g/mL)。經驗證，優化條件下提取的油橄欖葉粗多酚得率為2.54%，比均勻試驗中的 10 組試驗結果都高，說明優化結果具有指導意義。但是與回歸模型的預測值 2.67%有一定的誤差，相對誤差為 4.87%。該提取方法條件溫和，提取效率高。

2.4 食品添加劑對橄欖葉粗多酚加工穩定性的影響

2.4.1 甜味劑

圖7 甜味劑濃度對油橄欖葉多酚穩定性的影響Fig.7 Effect of sweetener concentration on the stability of polyphenols from olive leaves

由圖7可知，不同濃度的甜味劑對油橄欖葉多酚物質的穩定性影響不同，在葡萄糖、蔗糖、阿斯巴甜和木糖醇溶液中的多酚穩定性依次降低。當甜味劑溶液濃度在2.5～5.0 mg/mL時，多酚穩定性在葡萄糖和蔗糖中的變化不大，但是隨著濃度的增加，多酚穩定性在各種甜味劑中均降低。

2.4.2 防腐劑

圖8 防腐劑濃度對油橄欖葉多酚穩定性的影響Fig.8 Effect of preservative concentration on the stability of polyphenols from olive leaves

由圖8可知，在苯甲酸鈉和山梨酸鉀濃度均低于0.5 mg/mL時，多酚相對比較穩定。當兩種防腐劑濃度高于1.0 mg/mL時，多酚穩定性均變差。但是，苯甲酸鈉對油橄欖葉多酚穩定性的整體表現不如山梨酸鉀。

2.4.3 還原劑

圖9 還原劑濃度對油橄欖葉多酚穩定性的影響Fig.9 Effect of reductant concentration on the stability of polyphenols from olive leaves

由圖9可知，隨著還原劑濃度的增加，多酚穩定性逐漸降低。當還原劑濃度大于10 mg/mL時，對多酚穩定性有較大影響。

2.4.4 氧化劑

圖10 氧化劑濃度對油橄欖葉多酚穩定性的影響Fig.10 Effect of oxidant concentration on the stability of polyphenols from olive leaves

由圖10可知，隨著氧化劑濃度的增加，多酚穩定性逐漸降低。當氧化劑濃度大于15 mg/mL時，對油橄欖葉多酚穩定性有較大破壞作用。

3 結論

以橄欖葉粗多酚得率為指標，對復合酶的最佳配比進行優化。確定當使用纖維素酶∶果膠酶∶中性蛋白酶為1∶1∶2時，提取效果最佳，多酚得率為1.58%；在采用單因素和均勻試驗設計方法的基礎上，對酶法提取的工藝進行優化，并確定橄欖葉粗多酚的最佳提取方案為酶解時間40 min，酶解溫度 72 ℃，pH 值4.2，酶用量7.1%，料液比 1∶52(g/mL)。通過測定食品添加劑對橄欖葉粗多酚穩定性的影響，結果顯示：在葡萄糖、蔗糖、阿斯巴甜和木糖醇溶液中的穩定性依次降低，高添加量的糖類對橄欖葉多酚穩定性均有較大影響；低濃度山梨酸鉀中多酚穩定性較好，山梨酸鉀對多酚穩定性整體優于苯甲酸鈉；隨著氧化劑和還原劑濃度的增加，多酚穩定性逐漸降低。其中，高濃度氧化劑和還原劑對多酚穩定性破壞均有較大影響。

近年來，植物多酚因具有抗菌、抗病毒、抗氧化、提高機體免疫力等藥用價值和保健功效，被廣泛用于食品、日用品、化妝品和藥品行業，而開發簡單化、工業化的多酚提取技術成為未來急需研究的方向[15]。此外，多酚在產品中要更好地發揮作用，其穩定性不容忽視。因此，本文研究結果可為橄欖葉多酚的工業化和規模化提取，及其在食品、日用化妝品中的加工利用方案提供理論依據。