湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的巢式PCR檢測分析①

趙麗宏 劉建榮 張曼其 劉偉清 吳 凡 馮學娟

(廣東省湛江農(nóng)墾科學研究所 廣東湛江524086)

柑橘黃龍病（HLB）是柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，是由一種革蘭氏陰性細菌引起的，最早是在廣東省潮汕地區(qū)被發(fā)現(xiàn)的。該病害主要發(fā)生在非洲、亞洲、美洲和大洋洲等50多個柑橘種植國家［1］。中國柑橘黃龍病主要發(fā)生在江西、云南、四川、福建、廣東等11個柑橘生產(chǎn)省（市、自治區(qū)）［2］。該病害主要通過柑橘木虱、帶病的苗木、接穗等傳播，能侵染柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香等多種蕓香科植物［3-4］。由于黃龍病的病原菌是較難培養(yǎng)的細菌，因此分子水平上的研究一直無法深入開展，直至2009年才獲得黃龍病亞洲種全基因組序列［5］。早期通過觀察植株典型癥狀來進行黃龍病的田間形態(tài)學鑒定，具有一定的主觀性。隨著分子生物學的發(fā)展，目前主要采用PCR技術來檢測黃龍病的病原菌。Nested PCR是一種變異的聚合酶鏈式反應。程保平等［6］使用常規(guī)和巢式PCR 2種方法分別對同一樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)巢式PCR的檢測靈敏度大于常規(guī)PCR。

紅江橙是新會甜橙和福桔嫁接后形成的嵌合體植株，是一個早結、豐產(chǎn)、品質良好的紅肉甜橙新品種［7］，同時也是湛江農(nóng)墾的特色和名優(yōu)產(chǎn)品。由于其果肉紅潤、味道香濃、口感宜人，果皮薄滑、光亮，品質上乘，成為中國出口創(chuàng)匯水果佳品［8］。紅江橙是紅江農(nóng)場科技人員在1971年發(fā)現(xiàn)并培育而成的變異單株，于1972年開始選育種植，到1990年種植面積已達到1.33萬hm2［9］。后來由于黃龍病的大面積發(fā)生，紅江橙種植面積下降至0.19萬hm2，對湛江農(nóng)墾紅江橙產(chǎn)業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失，直到2008年才開始恢復種植［10］。柑橘黃龍病的發(fā)生，大幅降低了紅江橙的產(chǎn)量和品質，發(fā)病嚴重時會使整個果園絕收，造成巨大的經(jīng)濟損失。

針對柑橘黃龍病缺乏有效防治藥劑和抗病品種，目前主要采取以預防為主的方式來控制黃龍病的發(fā)生和蔓延［11］。因此，及時了解湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的發(fā)生情況，明確病害發(fā)生的原因，對于該病的有效防控具有重要的作用。2014年，黃勤知等［12］就已經(jīng)對紅江農(nóng)場的少部分果園進行黃龍病的抽查，但這已是幾年前的事了，目前很有必要對湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)的果園進行黃龍病發(fā)病率的抽查。2016～2018年，抽樣調查了湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的發(fā)生情況，對這2個果園紅江橙黃龍病進行檢測分析，為今后該病的有效防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

2016～2018年，在紅江農(nóng)場38隊紅江橙果園采集具有黃化、斑駁等癥狀的葉片樣本198個，于廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園采集具有上述相同癥狀的葉片樣本107個，共305個樣本。所采集的樣本按癥狀分類、拍照和整理后，取其葉片，用液氮研磨至粉末狀，放-20℃保存待用。所用陽性對照為經(jīng)測序驗證的感病紅江橙葉片，陰性對照采自湛江農(nóng)墾科學研究所脫毒的紅江橙母本園。

1.2 引物

根據(jù)柑橘黃龍病病原亞洲株系16S rDNA設計Nested PCR引物［13］，由上海生工生物工程技術有限公司合成。其中nested PCR的外側引物為P2-1（5'-TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC-3'）， P2-2（5'-AGAATTCGACTTAATCCCCACCT-3'）；內(nèi)側引物 P3-1（5'-GCGTTCATGTAGAAGTTGTG-3'），P3-2（5'-CCTACAGGTGGCTGACTCAT-3'）。

1.3 檢測方法

1.3.1 葉片DNA的提取

用解剖刀切取靠近中脈的部分葉片組織，按照上海生工《植物基因組DNA提取試劑盒》的操作方法提取，提取的DNA置于-20℃冰箱備用。

1.3.2 Nested PCR檢測

以提取的紅江橙葉片總DNA為模板，反應體系為20μL，進行nested PCR擴增。第一輪與第二輪的反應體系一樣，其中包括10×PCR buffer（含Mg2+） 2 μL， 2.5 mmol/L each dNTP 1.6 μL，1μmol/L 引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，模板DNA 1μL，H2O 13.3μL。使用引物P2-1/P2-2進行第一輪PCR擴增，然后取1μL第一輪PCR產(chǎn)物做第二輪PCR的模板，使用引物P3-1/P3-2進行第二輪PCR擴增。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；94℃變性40 S，55℃退火40 S，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。最后進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄結果。

2 結果與分析

2.1 部分樣本的PCR檢測結果

巢式PCR結果顯示，目的片段大小為400 bp。根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物有無DNA特異擴增條帶（400 bp）來判斷樣本中是否含有黃龍病的病原菌。若PCR為陽性，說明樣本中含有黃龍病的病原菌；若PCR為陰性，說明樣本中沒有檢測出黃龍病的病原菌。圖1為2016年紅江農(nóng)場38隊部分紅江橙葉片樣本 的檢結果。

圖1 2016年紅江農(nóng)場38隊果園部分紅江橙葉片樣本PCR擴增電泳圖

2.2 2016～2018年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病總的發(fā)生情況

305個葉片樣本黃龍病的檢測結果見表1。從表1中可以看出，305個樣本中有162個樣本呈陽性，黃龍病（HLB）的檢出率為53.1%。其中紅江農(nóng)場果園HLB的陽性檢出率較高，為55.6%。

表1 2016～2018年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的檢測結果

2.3 不同單位紅江橙HLB的發(fā)生情況

從表2、表3中可看出，不同采樣地點、不同采樣時間黃龍病的陽性檢出率存在一定的差異。從表2可看出，紅江農(nóng)場38隊紅江橙果園198個葉片樣本中有110個樣本呈陽性，HLB的檢出率為55.6%。

表2 2016-2018年紅江農(nóng)場38隊紅江橙果園黃龍病的檢測結果

同時也可看出，紅江農(nóng)場38隊紅江橙果園HLB的陽性檢出率逐年增加，2018年HLB的陽性檢出率高達70.7%。

從表3可看出，廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園107個葉片樣本中有52個樣本呈陽性，黃龍病的檢出率為48.6%；2017年黃龍病的陽性檢出率最高，為56.7%，2018年黃龍病的陽性檢出率較低，為42.9%。

表3 2016～2018年廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園黃龍病的檢測結果

造成該公司2018年黃龍病的陽性檢出率低于往年的原因可能是由于柑橘黃龍病的病原菌主要寄生于柑橘的維管束細胞中，病原菌在柑橘體內(nèi)的含量較少、分布不均勻，使得所采集葉片中病原菌含量較少，造成PCR結果出現(xiàn)假陰性。

2.4 不同年份紅江橙HLB的發(fā)生情況

2016～2018年湛江農(nóng)墾紅江農(nóng)場38隊紅江橙果園和廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園均有不同程度的黃龍病發(fā)生，且陽性檢出率逐年增加，2018年黃龍病的陽性檢出率高達62.4%。具體檢測結果見表4～6。

表4 2016年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的檢測結果

表5 2017年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的檢測結果

表6 2018年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園黃龍病的檢測結果

3 討論與結論

柑橘黃龍病（HLB）是一種細菌性病害，潛伏期長，且病原菌在柑橘組織中分布不均勻，這給黃龍病的早期檢測及防控帶來了困難［14-15］。加強柑橘黃龍病的檢測是預防黃龍病發(fā)生的基礎［16］，黃龍病可防控，但不可治療，這就需要加強該病害的早期檢測。因此，采用快速、準確、適用于大批量樣本的檢測技術對柑橘果園進行定期的監(jiān)測，對防治該病害的傳播蔓延具有極其重要的作用。

本研究明確了柑橘黃龍病在湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園中的分布及危害情況，為有效防控黃龍病提供科學依據(jù)。2016～2018年，筆者對這2個果園的紅江橙葉片樣本進行黃龍病的系統(tǒng)調查，采用nested PCR技術對具有黃化、斑駁等癥狀的305個葉片樣本進行黃龍病的檢測。結果發(fā)現(xiàn)，305個樣本中有162個樣本呈陽性，黃龍病的檢出率為53.1%。紅江農(nóng)場38隊紅江橙果園黃龍病的陽性檢出率為55.6%，且該果園黃龍病的陽性檢出率逐年增加，這一研究與黃勤知等［12］的研究是一致的；廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司黃龍病的陽性檢出率也很高，達到了48.6%，這說明黃龍病已在湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)的這2個果園普遍發(fā)生且危害較嚴重，同時也表明，按照黃龍病的典型癥狀如斑駁、黃化等進行采樣，陽性檢出率也很高。由于柑橘黃龍病是一種韌皮部革蘭氏陰性細菌，在柑橘組織中分布不均勻且含量較低［17］，采樣的差異也可能會使小部分材料出現(xiàn)假陰性。因此，采樣時要盡量選取有明顯癥狀的植株，從植株的不同方位（即東西南北中5個方位）均勻選取葉片進行檢測，以減少假陰性的出現(xiàn)［6］。此次對湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園的普查發(fā)現(xiàn)，個別樣本有典型的斑駁、黃化癥狀，但檢測結果為陰性，是否與樣本的采集有關有待進一步的證實。

通過對湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個果園具有黃化、斑駁等癥狀的紅江橙葉片樣本進行檢測，確定這2個果園出現(xiàn)的黃化、斑駁等癥狀是由黃龍病的病原菌引起的。程保平等［6］通過對柑橘多個品種和多個部位中黃龍病菌的檢測發(fā)現(xiàn)，失管果園是黃龍病傳播的源頭，黃龍病可能借助媒介昆蟲-柑橘木虱傳播到健康植株上。經(jīng)調查可知，湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)這2個果園的水肥、除草等田間管理水平相差不大，不同之處在于紅江農(nóng)場38隊果園周圍有很多農(nóng)戶種植紅江橙，且這些紅江橙大多處于失管狀態(tài)，雜草叢生，植株大都表現(xiàn)出黃化、斑駁等癥狀。黃龍病的平均檢出率為53.1%，說明紅江橙受黃龍病的危害較嚴重。廣墾（湛江）農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江果園周圍只有少量的農(nóng)戶種植紅江橙，黃龍病的平均檢出率為48.6%，相對于紅江農(nóng)場38隊果園來說發(fā)病率較低。這些現(xiàn)象說明果園周圍失管可能會導致蟲媒——柑橘木虱進入果園，危害該果園的紅江橙。因此不僅要加強對果園的水肥、除草等田間管理，還要加強種苗的檢測，以減少黃龍病對紅江橙的危害。

綜上所述，建議加強紅江橙種苗黃龍病的檢測檢疫以及果園的栽培管理，及時挖除感病植株，同時可補種無病的紅江橙大苗，預防柑橘木虱，堅持“預防為主、綜合防治”的原則，采取防病與防蟲相結合，化學藥劑與生物防治相結合的方法，增施有機肥或特種肥，結合修剪控梢增強樹勢，減少木虱的數(shù)量，杜絕病害的持續(xù)蔓延。