SNP array 在頸項透明層增厚胎兒產前診斷中的應用

李 瑞，時盼來，王愛玲，王建紅，肖艷華，孔祥東

（1.焦作市婦幼保健院醫學遺傳與產前診斷中心，河南 焦作 454000；2.鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心，河南 鄭州 450000）

近年來，在產前超聲檢查中，孕11～13+6周胎兒頸項透明層（nuchal translucency，NT）厚度被作為早期發現胎兒染色體異常，特別是非整倍體異常敏感且特異的指標之一[1-2]。大多數NT增厚胎兒在染色體核型正常的情況下預后良好，但少部分胎兒出生后合并神經系統發育異常或遺傳綜合征[3-4]，可能與染色體核型分析技術難以檢測染色體亞微觀結構異常有關。

染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）可檢測常規核型分析不能分辨的拷貝數變異（copy number variation，CNV），特別在染色體微缺失微重復檢出方面有出色的表現[5]。單核苷酸多態性微陣列技術（single nucleotide polymorphism array，SNP array）作為CMA技術中的一種，除可檢測CNV外，還可檢測出單親二體、三倍體（或其他多倍體）及一定水平的嵌合體。目前已有研究報道CMA可進一步檢出0%～8%的具有臨床意義的染色體微缺失和微重復[6]，但有關CMA在NT增厚胎兒中應用的報道較少，確切的臨床價值尚待大樣本數據支持。且不同研究對NT厚度截取的標準不同，尤其缺乏臨界性NT增厚（2.5～3.5 mm）胎兒相關研究數據。因此，本研究收集433份樣本，探討SNP array在孕11～13+6周超聲顯示胎兒NT增厚，特別是臨界性NT增厚中的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年4月—2018年10月鄭州大學第一附屬醫院產前診斷中心孕11～13+6周超聲顯示胎兒NT增厚（厚度≥2.5 mm），并接受產前診斷的孕婦431例，胎兒433例，其中426例單胎妊娠，3例雙胎妊娠（1例雙胎妊娠1個胎兒進行檢測，2例雙胎妊娠2個胎兒均進行檢測），雙胎妊娠均為雙絨毛膜雙羊膜腔。孕婦年齡20～45歲，平均（29.75±4.57）歲，孕周11+3～24+5周，平均（16.48±3.49）周。通過絨毛穿刺或羊膜腔穿刺獲取胎兒絨毛或羊水細胞進行產前診斷，絨毛標本121例，羊水標本312例。所有標本均采用SNP array進行全基因組染色體高分辨率掃描分析，同時應用多重定量熒光聚合酶鏈反應（quantitation fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR）快速檢測常見的21、18、13及性染色體數目異常。本研究經鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（KS-2018-KY-36），所有孕婦均經臨床咨詢并簽署知情同意書。

1.2 分組

（1）根據NT厚度分為4個組：A組NT厚度2.5～3.4 mm，共194例（44.80 %）；B組NT厚度3.5～4.4 mm，共132例（30.48 %）；C組NT厚度4.5～5.4 mm，共53例（12.24 %）；D組NT厚度≥5.5 mm，共54例（12.47 %）。（2）根據胎兒產前超聲的異常類型分為2個組，單純性NT增厚組373例（86.14 %）；合并其他超聲異常組60例（13.86 %），其中頸部水囊瘤21例、全身水腫8例、胎兒鼻骨缺失或發育不良6例、合并α波異常4例、其他單項異常17例；2項或2項以上異常4例。

1.3 標本收集

121例（27.94 %，121/433）孕婦（孕11～14周）在超聲引導下經腹行絨毛膜穿刺術，對所得宮腔內組織進行挑選，去除血塊、胎盤等組織，挑出1～2根長約5 mm的絨毛在0.9%氯化鈉溶液中洗凈。312例（72.06 %，312/433）孕婦（孕16～24周）在超聲引導下經羊膜腔穿刺術獲取羊水20 mL。對自愿接受染色體變異片段來源追蹤的胎兒父母，抽取其2 mL外周血于乙二胺四乙酸二鉀真空采血管，行父母驗證，用于鑒定CNV的性質。

1.4 基因組DNA提取

絨毛組織與外周血采用Eppendorf epMotion 5075 m工作站（德國Eppendorf公司）相應DNA提取程序提取全基因組DNA；羊水細胞使用基因組DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司），按照標準操作流程進行提取。提取的DNA置于-20 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.5 多重QF-PCR

選取21、18、13號染色體及性染色體上的短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）作為目的擴增片段，利用多重QF-PCR 檢測常見染色體數目異常。STR 位點共26個，其中21號染色體包括：D21S1435、D21S11、D21S1411、D21S1444、D21S1442和D21S1437；18號染色體包括：D18S978、D18S535、D18S386、D18S976和GATA178F11；13號染色體包括：D13S742、D13S634、D13S628、D13S305和D13S1492；性染色體包括：DXS1187、XHPRT、DXS2390、

SRY、DXYS267、DXYS218、AMELXY、AMELX、ZFY和ZFX；另含有T1（指示7號與X 染色體）及T3（指示3 號與X 染色體）位點。采用Devyser compact v3 kit（瑞典Devyser AB公司），按照說明書要求進行DNA提取，PCR擴增條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共26個循環。擴增產物用ABI-3130XL基因分析儀（美國ABI公司）進行毛細管電泳，并用配套軟件GeneMapper v3.2.1分析數據。根據臨床生化協會/臨床分子遺傳協會制定的標準[7]判斷結果。

1.6 SNP array檢測及數據分析

采用美國Affymetrix公司提供的高分辨率全基因組CytoScan 750K芯片嚴格按照Affymetric公司提供的操作流程，進行DNA消化、擴增、純化、片段化、標記信號、雜交、洗片染色以及掃描。采用Chromosome Analysis Suite（ChAS）軟件比對GRCH37（human genome 19，hg19）分析結果，結合鄭州大學第一附屬醫院產前診斷中心實驗室內部數據和國際在線基因組與表型公共數據庫，包括DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、Decipher（https：//decipher.sanger.ac.uk）、OMIM（http：//omim.org/）等分析結果。按照美國醫學遺傳學和基因組學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定的CNV臨床意義指南[8]要求對＞100 Kb的CNV致病性分為三類五級，本研究采用三分類，（1）致病性拷貝數變異（pathogenic copy number variation，pCNV）；（2）臨床意義不明確（variant of unknown significance，VOUS）CNV；（3）良性拷貝數變異（benign copy number variation，bCNV）。對VOUS的CNV進行父母驗證，如果胎兒CNV來源于父母，歸為bCNV。

1.7 統計學方法

采用 SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，頻次＜5的采用Fisher精確概率法；計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多重QF-PCR及SNP array總體檢測情況

QF-PCR 共檢出染色體數目異常49例（11.32%，49/433），檢出率最高的為標準型21-三體（6.47%，28/433），其次為18-三體（2.08%，9/433），特納綜合征最少（1.15%，5/433）。SNP array檢出了QF-PCR所檢出的所有染色體數目異常，另外檢出1例22-三體嵌合體，1例21-三體同時合并8號三體嵌合體，1例21-三體合并CNV異常。SNP array檢出的CNV變異種，對7例胎兒的父母進行了胎兒來源驗證，其中3例新發突變，4例為父母來源。驗證后共有15例pCNV，22例VOUS CNV，1例單親二倍體（uniparental disomy，UPD）。見表1。

2.2 不同分組的SNP array結果

A、B、C和D組染色體數目異常檢出率分別為4.64%、11.36%、26.42%和22.20%，pCNV檢出率分別為1.0%、4.5%、3.8%和9.3%，見表2。單純性NT增厚組染色體數目異常和pCNV檢出率分別為9.91%和2.14%，合并其他超聲異常組分別為21.67%、11.67%，見表3。

2.3 染色體數目異常及pCNV與孕婦年齡的關系

383例染色體數目正常與50例異常孕婦平均年齡分別為（29.581 6±4.423 6）歲與（31.220 0±5.463 4）歲，差異有統計學意義（P＜0.05）。418例非pCNV與15例pCNV孕婦平均年齡分別為（29.933 3±6.638 2）與（29.766 3±4.499 0），差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表1 多重QF-PCR與SNP array檢測結果 例/%

2.4 pCNV結果

SNP array共檢出15例pCNV，13例胎兒NT厚度≥3.5 mm；2例為2.5～3.4 mm，且合并其他超聲異常。見表5。

表2 不同NT厚度組的SNP array檢測結果例（%）

表3 單純性NT增厚組與合并其他超聲異常組SNP array檢測結果 例（%）

表4 不同組別孕婦年齡比較

表5 15例檢測pCNV胎兒相關臨床特征及檢測結果

3 討論

NT是妊娠11～13+6周胎兒頸背部出現的一層無回聲帶，為皮下組織內的液體積聚。在胚胎正常發育過程中，妊娠10～14周時頸部淋巴囊與頸靜脈竇相通，少量淋巴液積聚在頸部，出現短暫回流障礙，形成暫時性NT，正常妊娠NT厚度呈正態性分布。妊娠14周后，NT通常會消退，但部分病例會演變成頸部水腫或水囊瘤。有研究發現約20%的NT增厚胎兒染色體存在異常，且其發生概率隨著胎兒NT厚度的增加而增加[9-10]。YANG等[11]的研究結果顯示，在296例NT厚度＞3 mm的病例中，核型分析結果顯示染色體異常的病例占19.9%（59/296）。1項孕早期超聲篩查胎兒NT的研究發現，218例NT增厚的病例中染色體異常占22.02%（48/218），其中數目異常39例，數目異常中21-三體綜合征所占比例達50%（24/48），其次為18-三體綜合征，占16.67%（8/48）[12]。另一項研究得出了相同的結論，NT增厚且染色體異常的胎兒中，21-三體綜合征占50%、18-三體綜合征或13-三體綜合征占25%、特納綜合征占10%[13]。本研究結果顯示，433例NT增厚胎兒中，染色體數目異常發生率隨NT增厚而增高，厚度在2.5～3.4 mm時，數目異常發生率為4.64%，厚度在3.4～4.4 mm時，數目異常發生率為11.36%，當厚度超過4.5 mm時，發生率＞20%。本研究的結果稍低于相關研究[11-13]，可能與SNP array檢測內容僅為數目異常，不能檢出核型分析所能檢出的易位、倒位等平衡性結構異常有關。數目異常發生率居前3位的分別是21-三體綜合征、18-三體綜合征及特納綜合征，與相關報道一致。

BORNSTEIN等[14]報道在NT增厚胎兒中pCNV整體檢出率為4.3%，在單純性NT增厚病例中為1.6%，合并其他異常時檢出率為5.9%。HILLMAN等[15]結合文獻分析發現，單純性NT增厚胎兒pCNV的檢出率為3.6%，當合并其他超聲異常時，pCNV檢出率為5.2%。本研究結果顯示，NT厚度超過3.5 mm時，pCNV發生率在4%以上，單純性NT厚度增厚的病例中pCNV發生率為2.14%（8/373），基本與文獻報道一致。然而，本研究發現NT增厚合并其他超聲異常時，pCNV發生率為11.67%（7/60），高于相關報道，可能與患者納入標準或病例標本量較少有關，具體結論還有待進一步研究。通過統計學分析可以看出，NT增厚合并其他超聲異常的pCNV檢出率為11.67%，明顯高于單純性NT增厚組的2.14%，建議NT增厚合并其他超聲異常的胎兒在染色體核型分析或數目分析正常后進行CMA檢測。

有研究認為孕婦年齡增大與染色體不分離有關，染色體數目非整倍體發生率隨孕婦年齡增長而增高[16]，特別是21-三體發生率在≥35歲孕婦中顯著增加[17-18]。本研究結果也印證了這一結論，染色體數目異常組孕婦年齡與染色體數目正常組比較具有明顯的統計學差異。但是pCNV組與非pCNV組的孕婦平均年齡分別為（29.77±4.50）和（29.93±6.64）歲，并無顯著差異，這提示導致染色體微缺失、微重復與數目異常的原因并不同，具體機制還有待研究。因此，在選擇CMA檢測指標時，不應將孕婦年齡作為影響因素。

目前，國際上對于NT截斷值采用NT厚度超過第95百分位數還是第99百分位數存在爭議。在我國，NT增厚截斷值亦缺乏統一標準。本研究結果顯示，194例臨界性NT厚度（2.5～3.4 mm）胎兒與239例NT厚度超過3.4 mm胎兒，無論染色體數目異常還是pCNV發生率均存在統計學差異。且pCNV情況顯示，NT厚度為2.5～3.4 mm的2例pCNV胎兒同時合并其他超聲結構異常。因此，本研究認為不應該常規對臨界性NT厚度胎兒行CMA檢測，除非胎兒同時合并其他指征。

NT厚度對于孕早期提示染色體異常發生率具有重要意義，如果及時進行檢驗，可以極大地將診斷窗口前移。染色體G顯帶核型分析作為臨床上染色體病診斷的金標準，孕早期受制于細胞培養失敗率較高，且耗時較長（7～21 d），不利于盡早診斷。本研究采用QF-PCR進行檢測，可快速、準確檢測21、18、13及性染色體數目異常。聯合SNP array在全基因組水平高分辨（100 Kb）檢測染色體CNV，染色體數目變異檢出率為11.55%（50/433），pCNV變異檢出率為3.46%（15/433）。從本研究結果可以看出，染色體數目異常的發生率遠高于CNV，產前診斷在不能采用核型分析金標準方法檢驗時，應首先通過QF-PCR檢測排除染色體數目異常，再采用CMA檢測CNV，以最快速地報告診斷結果。

綜上所述，NT厚度及其是否合并其他超聲指標異常與染色體數目異常及pCNV均存在一定的關聯性，建議采用NT厚度超過第99百分位數（3.5 mm）時為截斷值進行相應檢測。孕婦年齡與pCNV發生率無關。對于孕早期NT增厚的胎兒，應聯合應用多重QF-PCR與CMA進行快速準確的產前診斷。