新型環烯烴聚合物微流控芯片的設計及其在大腸埃希菌O157：H7 快速檢測中的應用

高菊逸，吳傳安，楊偉康，羅裕旋，劉勝楠，徐小平

（1.深圳市龍華區婦幼保健院，廣東 深圳 518110；2.香港大學深圳醫院，廣東 深圳 518053）

大腸埃希菌O157：H7是大腸埃希菌中可引起人類發病最多的血清型之一，可從牛肉或牛奶等食物中被分離到，主要引起人的出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合征，病死率較高[1-4]。因此，該菌在食品安全等方面具有重要的研究價值。本研究利用微流控芯片技術建立了一種快速檢測大腸埃希菌O157：H7的技術平臺，具有耗材成本低、操作簡便、檢測時間短、靈敏度高等優點。

1 材料和方法

1.1 微流控芯片設計及制作

取25μmOCA光學透明膠，利用計算機輔助軟件（Pro/Engineer）設計的長160 μm、寬40 μm的流體通道，采用激光雕刻技術切出設計圖形（圖1）。將合適尺寸的環烯烴聚合物（cycloolefin polymer，COP）與OCA光學透明膠一同放入O2等離子進行清洗（100 mW，1% O2，60 s）后取出，用OCA光學透明膠將上、下2層COP進行不可逆鍵合，放入80 ℃烤箱烘烤10 min。芯片制作完成后，將可食用性染料通入芯片，用于驗證芯片的實用性（圖2）。

圖1 微流控芯片設計圖

圖2 微流控芯片實物圖

1.2 芯片檢測區域表面修飾和抗體固定

通過注射泵控制反應通道內反應液的流動，采用巰基-馬來酰亞胺基團硅烷化偶聯法，對反應檢測區進行表面修飾和抗體固定[5-7]。具體步驟為：用注射泵往通道中通入5 μL 3-巰基丙基三甲氧基硅烷（3-methyl propyl trimethoxy silane，MPTS）（5%，溶于無水乙醇溶液），5 μL N-（4-馬來酰亞胺丁酰基氧）琥珀酰亞胺（4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester，GMBS）

（2 mg/mL，溶于二甲亞砜溶液），分別在室溫下反應1 h和30 min，反應后用無水乙醇和磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗。清洗后，通入5 μL鏈霉親和素溶液（1 mg/mL，溶于PBS），室溫下反應1 h。PBS清洗后，通入5 μL生物素標記羊抗O157：H7大腸埃希菌菌體抗原抗體（單抗，美國KPL公司）（10 μg/mL，溶于含1%牛血清白蛋白的PBS）（圖3），室溫下反應30 min后沖洗備用。

圖3 芯片內表面修飾

1.3 菌株來源及樣本制備

1.3.1 菌株來源 大腸埃希菌O157：H7菌株（深圳市疾病預防控制中心），大腸埃希菌（ATCC 25922）、傷寒沙門菌（ATCC 14028）（香港大學深圳醫院微生物科），大腸埃希菌O157：H7顯色培養基（法國科瑪嘉公司），EC肉湯培養基（廣東環凱公司）。

1.3.2 樣本制備 取接種了大腸埃希菌O157：H7并過夜培養后的營養肉湯菌懸液0.2 mL，加入無菌0.9%氯化鈉溶液，調成濃度為1.6×107CFU/mL的初始菌液（經平板菌落計數確定濃度），10倍稀釋至1.6×101CFU/mL，每個濃度各取1 mL菌液于沸水中煮15 min滅活，離心備用。大腸埃希菌（ATCC 25922）和傷寒沙門菌（ATCC 14028）也分別按上述方法進行培養并計數，制成1×107CFU/mL的菌懸液，離心備用。陰性對照為高壓滅菌的PBS緩沖液，陽性對照（自制）為經熒光染料V3染色的大腸埃希菌O157：H7菌液（濃度為1×106CFU/mL）。

1.4 確定最佳進樣流速和進樣時間

采用注射泵分別以0.5、1.0、3.0、5.0 μL/min的速度往芯片內通入陽性對照液，每隔5 min記錄1次熒光信號值，直至60 min。當進樣速度為0.5 μL/min時，芯片反應區內的熒光信號強度可達到最高，到達最高值需要1 h；當進樣速度為1.0 μL/min時，芯片反應區內的最高熒光信號強度比0.5 μL/min時略低，達到最高值需要30 min；隨著進樣速度的加快，反應區內的熒光信號強度達到最高值的時間也逐漸縮短，但熒光信號最高值也逐漸下降。因此，后續試驗選擇1.0 μL/min和30 min為最佳進樣速度和反應時間。見圖4。

圖4 反應條件優化結果

1.5 樣本的檢測

采用注射泵將待測樣本及陰、陽性對照液各30 μL以最佳進樣速度從通道通入芯片內。反應30 min后，以PBS沖洗，再以最佳進樣速度從通道通入5 μL異硫氰酸熒光素標記羊抗大腸埃希菌O157：H7菌體抗原單克隆抗體（50 μg/mL，溶于含1%牛血清白蛋白的PBS）。反應30 min并沖洗后，將芯片置于倒置熒光顯微鏡下觀察檢測區域內的熒光，并用電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）拍照記錄（20倍，曝光時間1.25 s），最后用Image-Pro Plus 5.0軟件分析各檢測區域的熒光信號。熒光信號強度高于陰性對照熒光值+3s者為陽性，反之為陰性[8]，其中陰性對照熒光值為465～495。

1.6 確定檢測靈敏度和特異性

分別取1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的大腸埃希菌O157：H7菌液，并以0.9%氯化鈉溶液做陰性對照，以最佳進樣速度通入芯片內進行檢測，采用SPSS 13.0軟件對結果進行統計學分析，通過獨立樣本t檢驗結果確定新型微流控芯片的最低檢測限，即靈敏度。

分別取1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的大腸埃希菌（ATCC 25922）及傷寒沙門菌（ATCC 14028）菌液進行檢測，觀察檢測結果，確定特異性。

2 結果

2.1 新型COP微流控芯片的優勢

本研究采用激光雕刻機為加工儀器、以OCA光學透明膠為主要材料制作的微流控芯片，與采用光刻機制作的微流控芯片相比，具有制作過程簡單、制作速度快、成本低、環保、節能等優點。芯片的制作只需1 min即可完成，而且采用的儀器價格低廉、便于攜帶，對試驗環境、人員要求低，適合院外或床旁檢測。臨床上傳統的細菌檢測一般需要48～72 h，而這種新型的技術只需30 min～1 h即可完成檢測，樣本和試劑用量少、不需大型設備、費用低廉。

2.2 檢測限

分別檢測大腸埃希菌O157：H7菌液和對照液，每個濃度平行測定3次。微流控芯片檢測區域內的熒光信號強度隨著大腸埃希菌O157：H7菌液濃度的遞增而逐漸增強，形成1個S形曲線，而陰性對照組熒光信號強度保持在極低的水平。以細菌濃度對數值（CFU/mL）為橫坐標，以熒光信號對數值為縱坐標，得到濃度反應曲線。根據最低檢測限為熒光信號強度高于陰性對照熒光值+3s者的樣本濃度[9]，確定本方法對大腸埃希菌O157：H7的檢測限為1×103CFU/mL。見圖5。

2.3 特異性

取濃度為1×107CFU/mL 的大腸埃希菌O157：H7、大腸埃希菌（ATCC 25922）和傷寒沙門菌（ATCC 14028）菌液各30 μL，每個樣本平行測定3次。在通入相同濃度的菌液后，大腸埃希菌O157：H7的熒光信號強度比通入大腸埃希菌（ATCC 25922）及傷寒沙門菌（ATCC 14028）的熒光信號強度高出3個數量級，熒光信號對數值差異具有統計學意義（t=5.324，P＜0.01），表明此方法對大腸埃希菌O157：H7的檢測具有很高的特異性。見圖5。

圖5 微流控芯片檢測大腸埃希菌O157：H7的靈敏度和特異性

2.4 可重復性

取濃度為1×106CFU/mL的大腸埃希菌O157：H7菌液，分為10份，按上述方法進行檢測。結果顯示，同批檢測的精密度（以相對標準偏差表示）為5.2%，表明此方法具有較好的可重復性。

2.5 模擬臨床樣本的檢測

取100份正常人臨床糞便樣本，挑取少量樣本制成糞便懸液樣本，加入已知濃度的大腸埃希菌O157：H7，配置成含不同濃度大腸埃希菌O157：H7（1×103～1×106CFU/mL）的陽性樣本50份，及不含大腸埃希菌O157：H7的陰性樣本50份。700×g離心15 s后用紗布過濾，每份樣本都同時以微流控芯片法和培養法進行檢測，最后計算出微流控芯片法的敏感性、特異性及2種方法的符合率。培養法參照《全國腸出血性大腸埃希菌O157：H7感染性腹瀉監測方案》[10]進行檢測和鑒定。結果顯示，微流控芯片法檢測糞便樣本中大腸埃希菌O157：H7的敏感性為90%，特異性為100%，二者符合率達95%。見表1。

表1 2種方法檢測結果比較 份

3 討論

微流控芯片技術是目前生物化學、藥物、化學合成及臨床診斷等領域的重要研究內容。但隨著研究的不斷深入，微流控芯片技術的發展也逐漸暴露出一些問題，如系統操作復雜、相關研究力量薄弱、對技術人員要求高、制作工藝局限性大等。為了實現技術上的突破，本研究團隊前期研究通過雙面黏性薄膜微流控芯片實現了對循環腫瘤細胞的捕獲，對乳腺腫瘤細胞的捕獲率為（92±3）%，證明這種材料制作的微流控芯片在實際應用中是可行的，可大大降低人力和物力成本。本研究采用OCA光學透明膠和COP研制的新型塑料微流控芯片，進一步提高了材料的選用標準，可在管道中增加結構，提高芯片的檢測范圍，再結合表面修飾技術和免疫熒光技術，大大降低了技術成本，其中表面修飾固定抗體環節還利用等離子清洗等工序，使得檢測系統的靈敏度有了更好的保障。

本研究建立的COP微流控芯片系統只需30 min～1 h即可完成檢測，不需大型設備，樣本和試劑用量少，且低碳、環保，對大腸埃希菌O157：H7的檢測限為1×103CFU/mL。經模擬實驗驗證，此法檢測敏感性為90%，特異性為100%，與李永新等[11]采用微流控芯片-激光誘導熒光快速檢測大腸埃希菌O157：H7的檢測限相近，但本研究的芯片制作過程簡單、速度快、成本低，更適合用于院外及床旁檢測。此外，該微流控芯片不僅可用于檢測同一種病原菌，還可以采用多通道同時檢測多種病原菌，可作為疾病早期對病原菌的快速篩查方法，對臨床快速獲得病原菌信息，制定個性化治療方案具有重要意義。