國產全自動HIV-1 核酸定量檢測試劑盒的性能評價

楊 勇，蒲 偉，羅小虎

（巴中市疾病預防控制中心，四川 巴中 636600）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的一種免疫缺陷性疾病[1]，治療困難極大，極易引起多種并發癥，最終導致患者死亡[2]。因此，如何有效控制AIDS流行是目前醫學界面臨的難題。由于目前還沒有能有效治療AIDS及預防HIV感染的藥物，因此現在只能通過早期篩查，查找傳染源，從根本上切斷HIV的傳播途徑，以有效避免AIDS的傳播[3]。HIV抗體檢測是診斷HIV感染的首選方法。HIV核酸檢測可作為輔助檢查手段使用，可用于HIV感染過程、病情進展及藥物療效的評估[4]。人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）核酸檢測方法能夠定量檢測患者的HIV-1載量，準確反映體內病毒含量，對于疾病診斷及療效評估具有重要意義[5]。雖然HIV-1核酸定量檢測試劑早已用于臨床，但大部分試劑為進口，價格昂貴，而且需要昂貴的儀器設備，導致檢測費用居高不下，難以在基層醫院及基層疾病控制中心推廣[6-7]。因此，開發檢測性能與進口試劑盒相當的國產試劑盒迫在眉睫[8]。目前，國內已有廠商自主研發了一些HIV-1核酸定量檢測試劑盒，并用于臨床檢測，但準確性、敏感性尚不明確。本研究擬對國產全自動HIV核酸檢測試劑的主要性能進行評估，并與進口試劑進行比對，探討其臨床應用的可行性。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集巴中市疾病預防控制中心2018年2—5月210例臨床樣本，其中男127例、女83例，年齡15～68歲。感染HIV-1的樣本190例，非HIV-1感染樣本20例。所有樣本均采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，1 000×g離心15 min，吸取上層血漿待測。所有樣本均無重度溶血、變質及反復凍融等情況。

1.2 儀器與試劑

靈敏度/定量參考品（HIV-1 RNA為 4.04×105IU/mL）及參考品稀釋液購自中國食品藥品檢定研究院（批號220017-20140930）。DYSW-AUTO48全自動液體處理工作站及Line-Gene 9600 Plus實時熒光定量PCR檢測系統均購自東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司。cobas AmpliPrep/cobas Taq-Man全自動核酸提取純化及實時熒光定量PCR檢測系統購自瑞士羅氏公司。待測試劑為NEPG全自動HIV-1核酸定量檢測試劑盒（簡稱國產NEPG HIV-1試劑，批號2018001），購自東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司。參比試劑為cobas AmpliPrep cobas TaqMan HIV-1 Test v2.0試劑盒（簡稱進口HIV-1試劑，批號Y06193），購自瑞士Roche公司。2種試劑盒的技術參數見表1。

表1 國產NEPG HIV-1試劑和進口HIV-1試劑的技術參數

1.3 方法

1.3.1 準確性 將靈敏度/定量參考品用參考品稀釋液稀釋成低（5.0×102IU/mL）、中（5.0×103IU/mL）、高（5.0×104IU/mL）3個濃度，采用國產NEPG HIV-1試劑檢測，每個濃度重復檢測3次，計算均值。將檢測結果用lg函數轉換成對數值。絕對偏差=測定結果均值的對數值-預期值的對數值。根據我國醫藥行業標準YY/T 1182—2010中的要求，絕對偏差≤±0.5個對數數量級為符合要求。

1.3.2 靈敏度 將靈敏度/定量參考品用參考品稀釋液稀釋至200、100、50、25 IU/mL，采用國產NEPG HIV-1試劑檢測，每個濃度重復檢測3次，計算可檢出濃度。

1.3.3 對照試驗 分別采用待測試劑和參比試劑雙盲檢測同份一血漿樣本，評價2種試劑的符合率和一致性。待測試劑的定性結果判斷：如果擴增曲線不呈現S型曲線或循環閾值（cycle threshold，Ct）為0，同時內標檢測為陽性，報告為HIV-1 RNA陰性；除此之外，其他情況加上內標檢測為陽性均判定為HIV-1 RNA陽性。

1.3.4 單位換算 根據基于核酸技術的HIV-1 RNA世界衛生組織第1代國際標準品（NIBSC 97/656）[9]，1拷貝/mL相當于1.67 IU/mL。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，組間比較采用配對t檢驗。采用Kappa檢驗評價2種試劑定性結果的一致性。采用線性回歸分析評價2種試劑定量結果的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 準確性分析

低、中、高濃度樣本測定結果的絕對偏差分別為0.05、0.08、-0.06，均符合要求。見表2。

表2 國產NEPG HIV-1試劑的準確性

2.2 靈敏度分析

濃度為200、100、50 IU/mL的樣本各檢測3次，結果均為陽性。濃度為25 IU/mL的樣本檢測3次，有1次未檢出。因此，國產NEPG HIV-1試劑的靈敏度為50 IU/mL（約30 拷貝/mL）。見表3。

表3 國產NEPG HIV-1試劑的靈敏度

2.3 對照試驗定性結果分析

分別采用國產NEPG HIV-1試劑和進口HIV-1試劑檢測210例樣本，檢測結果均為陽性的有164例，均為陰性的有46例，2種試劑定性結果的符合率均為100.00%，定性結果一致（Kappa值=1.00）。見表4。

2.4 對照試驗定量結果分析

將164例陽性樣本檢測結果以lg函數轉換成對數值，評價定量結果的相關性。線性回歸分析結果顯示，2種試劑檢測HIV-1載量的相關性良好（r=0.953），見圖1。2種試劑之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 2種試劑定性結果的一致性比較例（%）

圖1 國產NEPG HIV-1試劑與進口HIV-1試劑的相關性分析

由于核酸定量試劑在最低檢測限和最低定量限區域內的檢測結果可能會出現偏差，所以根據低病毒血癥的HIV-1載量（50～1 000拷貝/mL），并結合國內外試劑的檢測限和定量限，將定量檢測結果的低值區域定為20～1 000拷貝/mL。164例陽性樣本中低值樣本為31例。對2種試劑檢測低值樣本的結果進行相關性分析，結果顯示相關性較好（r=0.823）。

3 討論

本研究使用的DYSW-AUTO48全自動液體處理工作站采用納米磁珠分離技術從樣本中分離、純化核酸。從加樣開始，全自動完成樣本裂解、核酸吸附、清洗、洗脫和試劑配置，無需人工干預，有效避免了人為因素的干擾，還能減少操作人員與臨床樣本的接觸，降低生物安全風險，且成本較低、操作簡便。

本研究結果顯示，國產NEPG HIV-1試劑與進口HIV-1試劑的檢測符合率為100.00%，相關性良好（r=0.953），低值樣本的相關性也較好（r=0.823），由此說明國產NEPG HIV-1試劑與進口HIV-1試劑檢測結果的一致性良好。國產NEPG HIV-1試劑的靈敏度為50 IU/mL（約30拷貝/mL），樣本用量較少（400 μL），與廠商聲明（檢測下限為50 IU/ml）一致。由于部分HIV-1感染者在抗病毒治療過程中會出現持續性低病毒血癥，病毒載量為50～1 000拷貝/mL，與耐藥發生、病毒學檢測失敗、持續性炎癥、微生物移位、高死亡率等密切相關[10]，所以HIV檢測試劑的高靈敏度性能具有重要的臨床意義。

綜上所述，國產NEPG HIV-1試劑可以滿足臨床應用要求，檢測成本較低，檢測性能與進口HIV-1試劑相當，可用于HIV-1感染的早期診斷、疑難樣本的輔助診斷及AIDS的病情監測等。