響應面法優化乳源蛋白水解工藝

范夢珠，郭婷，林文珍，李文瑾，陳平，洪志駿，張少輝,

（1.上海交通大學農業與生物學院，上海200240；2.浙江熊貓乳業集團股份有限公司，浙江溫州325800；3.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0引言

蛋白質在人們的營養結構組成中占據重要位置。蛋白在水解后其分子量明顯變小，隨著蛋白水解程度的增加，其抗原性明顯降低[1]。水解度是衡量蛋白水解程度最主要的因素，影響著蛋白水解產物的功能特性如乳化、凝膠、風味等[2-3]。脫脂乳蛋白種類豐富，有研究表明不同蛋白種類的水解產物對健康人的飽腹感和抑制食欲激素的分泌會產生一定的影響[4]。因此，脫脂乳源蛋白水解產物對于代餐等功能性食品的開發有重要價值。

目前，水解蛋白的制備方法主要有酸水解法、堿水解法和酶水解法。酸水解和堿水解都有一定的弊端且不具有專一性[5]。酶水解法的主要優勢是水解條件溫和、副反應少、不破壞敏感氨基酸和水解產物，在營養、風味、工藝等方面均優于酸、堿水解法[6-7]。因酶具有專一性的特點，而脫脂乳中蛋白種類豐富，因此單純用酶對脫脂乳蛋白進行水解并不能達到很好的效果。

乳酸菌是一類重要的益生菌，瑞士乳桿菌是乳酸菌中營養缺陷型最高的菌種之一，具有強大的蛋白水解能力，其蛋白水解產物具有抗高血壓、提高免疫力、消炎和抗癌等功能[8-11]。本文是采用瑞士乳桿菌與酶結合對乳源蛋白進行水解的方法，以蛋白水解度為指標，并通過響應面法對工藝進行優化，為益生菌水解蛋白粉的工業化生產提供參考。

1材料及方法

1.1材料

MRS培養基，青島海博生物技術有限公司；脫脂乳，恒天然商貿(上海)有限公司；瑞士乳桿菌CICC6024，北京北納創聯生物技術研究院；復合胰蛋白酶（酶活力2×105 u/g），AB Enzymes公司；酸性蛋白酶（酶活力1×105 u/g），寧夏夏盛實業集團有限公司；胃蛋白酶（酶活力4×105 u/g），默克生命科學（上海）有限公司；氯化鈉NaCl，上海凌峰化學試劑有限公司；其余試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2設備

JB-VS-1300U超凈工作臺，上海屹明凈化設備有限公司；SCIENTZ真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250F生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；GI36T高壓滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；Froma 700低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RO 15純水系統，力康生物醫療科技控股有限公司；GL-22M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1益生菌水解蛋白粉制備工藝

操作要點如下：（1）菌種活化，取本實驗室-80℃低溫冰箱中凍存的瑞士乳桿菌CICC6024，置于37℃恒溫培養箱中解凍10 min。將解凍后的瑞士乳桿菌接種于滅菌的MRS液體培養基中，接種量5%（v/v），37℃靜置培養12 h，此為第一次活化。從活化發酵液中取活化后的菌液再次接種于MRS液體培養基中，接種量2%（v/v），37℃靜置培養8 h，此為第二次活化。取二次活化的菌液使用。（2）酶溶液制備方法[12]。分別稱取復合胰蛋白酶0.25 g、酸性蛋白酶0.5 g、胃蛋白酶0.125 g溶于10 mL滅菌RO水中，并依次通過0.45 um濾膜、0.22 um濾膜進行過濾除菌，分別得到酶活力為5 000 u/mL的復合胰蛋白酶溶液X,酸性蛋白酶溶液Y、胃蛋白酶溶液Z，現配現用。（3）脫脂乳濃度為12%（w/w），95±1℃巴氏殺菌5～6 min，然后冰水浴快速冷卻至42℃以下，然后接種二次活化后的菌液，在接種菌液的同時按比例接種X、Y、Z，37℃恒溫培養箱靜止發酵一定時間得到發酵液。（4）離心參數為2 500 g、4℃、10 min。（5）真空冷凍干燥條件為溫度-68±2℃，時間48 h，真空度2 Pa。

1.3.2蛋白酶種類的篩選及水解度的測定

質量分數為12%（w/w）脫脂乳用0.1 mol／L的NaOH調至p H 7.0，95℃滅菌5min，冰水浴快速冷卻后接種二次活化后的瑞士乳桿菌菌液，接種量2%（v/v）。酶制劑的添加方式參考[13]，具體如下：根據蛋白酶的活性在接種菌種的同時分別加相應比例的X、Y、Z蛋白酶溶液，蛋白酶用量60 u/mL，37℃恒溫培養箱中發酵24 h，期間每隔2 h取一次樣品，進行水解度的檢測。水解過程中用0.5 mol／L NaOH中和水解液，用PH-stat法測水解度[14]，水解后的水解液95℃滅酶5 min，水解度計算公式：

水解度DH%=(B×M b)/(α×M p×htot)*100%

式中：B-NaOH體積，mL

M b-NaOH濃度，mol/mL

α-氨基的平均解離度，酪蛋白的1/α為2.26

M p-蛋白質的質量，g

htot-對于酪蛋白，取值為8.2 mmol/g

1.3.3單因素實驗

根據試驗結果篩選確定復合胰蛋白酶X為最佳蛋白酶后，進行如下單因素實驗。

（1）發酵時間的單因素實驗，條件為：復合蛋白酶用量60 u/mL、發酵溫度37℃，發酵時間分別取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h對水解度進行測定。

（2）蛋白酶用量的單因素實驗，條件為：發酵時間12 h，發酵溫度37℃，復合胰蛋白酶用量分別取0、20、40、60、80、100、120、140、160 u/mL對水解度進行測定。

（3）發酵溫度的單因素實驗，條件為：發酵時間12 h，復合蛋白酶用量60 u/mL、發酵溫度分別取31、34、37、40、43℃對水解度進行測定。

1.3.4響應面優化實驗

以單因素實驗的結果為基礎，以水解度為指標，根據Box-Behnken中心設計實驗原理進行響應面法優化，選取發酵時間、酶制劑的添加量、發酵溫度3個影響因子，分別選取3個水平，采用3因素3水平的響應面曲面分析方法，對水解條件進行優化設計，確定最佳工藝參數。

2結果與分析

2.1蛋白酶的篩選

根據已有的研究結果，酸性蛋白酶和瑞士乳桿菌協同發酵可以顯著提高乳源性生物活性肽的產量[12]。復合胰蛋白酶和胃蛋白酶是酶解法降解蛋白，提高蛋白水解度常用的兩種蛋白酶[15]。因此，在菌酶協同發酵實驗中選擇這三種蛋白酶研究發酵時間與不同種類蛋白酶對乳源蛋白水解度的影響，結果如圖1所示。

圖1不同蛋白酶及酶解時間對蛋白水解度的影響

從結果可以看出，發酵時間在4 h以內，胃蛋白酶、酸性蛋白酶、復合胰蛋白酶和不加酶組對蛋白水解度影響差異不大，在4 h以后復合胰蛋白酶組對蛋白的水解優勢明顯優于其他三組。原因可能是在發酵初期由于p H的影響，蛋白酶的活性受到抑制，加酶組和不加酶組對蛋白水解度的影響并無較大差異。在4 h后，復合胰蛋白酶的表現出的活性最強，在整個發酵期間對蛋白水解的效果明顯優于另外三組，因此選擇復合胰蛋白酶用于后續試驗。

2.2單因素實驗

2.2.1發酵時間對蛋白水解度的影響

由圖1可知，發酵初期蛋白水解度基本并無較大差異，發酵時間超4 h后，蛋白水解度開始出現明顯增加，12～24 h之間蛋白水解度呈現輕微波動，在16 h處蛋白水解度達到最大值，為71.65±3.08%，統計分析結果表明12 h、16 h處的水解度并無顯著性差異（P＞0.05）。分析認為，瑞士乳桿菌是高度營養缺陷型的乳酸菌，自身可以產生豐富的蛋白酶系分解底物，滿足自身的生長，從整個協同發酵過程可以看出，瑞士乳桿菌自身表現出強大的蛋白水解能力，外源復合胰蛋白酶起到輔助作用。發酵初期，培養液沒有達到瑞士乳桿菌生長的最適p H值，其生長受到抑制，對蛋白水解的程度不高，在4 h后，逐漸進入瑞士乳桿菌的對數期，水解程度開始出現快速增加。達到最大值后水解度出現輕微波動，一方面考慮到底物營養被瑞士乳桿菌吸收利用后逐漸減少，一方面可能是瑞士乳桿菌的代謝產物積累抑制了反應的進行。根據實際的生產情況，考慮到生產效率，確定12 h為最佳發酵時間，此條件蛋白水解度為68.21±2.88%。

2.2.2酶的添加量對蛋白水解度的影響

由圖2可知,胰蛋白酶劑量的增加有助于蛋白水解度的提高，最佳復合胰蛋白酶用量為80 u/mL，此條件下的水解度為69.24±3.12%。當復合胰蛋白酶用量小于80 u/mL時，蛋白水解度隨著蛋白酶用量的增加而增加；當用量高于80 u/mL時，蛋白水解度反而出現輕微下降，原因可能是隨著外源蛋白酶用量增加到一定程度后，一方面出現了酶與底物結合位點的飽和，另一方面外源蛋白酶對瑞士乳桿菌自身產生的酶系產生一定抑制作用，影響了瑞士乳桿菌自身的生理活動，使蛋白水解度下降。

圖2胰蛋白酶用量對蛋白水解度的影響

2.2.3發酵溫度對蛋白水解度的影響

由圖3可知，發酵溫度對蛋白水解度影響較大，隨著溫度的升高，蛋白水解度呈現先上升后下降的趨勢。當溫度達到37℃，蛋白水解度最高，為71.25±2.12%，這可能是因為37℃是瑞士乳桿菌的最適生長溫度，自身產生蛋白酶的能力最強。隨著溫度升高，自身生長受到抑制導致自身產生的蛋白酶的量減少，加上酶的活性也受到抑制，因此水解度急劇下降。

圖3發酵溫度對蛋白水解度的影響

由單因素試驗結果可知，以脫脂乳源蛋白水解度為指標，復合胰蛋白酶與瑞士乳桿菌協同發酵作用最佳，最佳發酵條件為：發酵時間12 h，復合胰蛋白酶用量80 u/mL，發酵溫度37℃。以此實驗結果的基礎上，進行響應面優化試驗。

2.3響應面優化蛋白水解工藝條件

2.3.1響應面實驗設計與結果

在單因素實驗結果的基礎上，采用Box-Behnken中心組合設計原理，以發酵時間（A）、酶用量（B）、發酵溫度（C）為自變量，以蛋白水解度為響應值進行響應面試驗設計，試驗設計及結果見表1，具體分析結果見表2。

表1 Box-Behnken實驗設計與結果

由表2可知，此回歸方程模型顯著性檢測P＜0.0001，極顯著，表明該回歸方程模型具有統計學意義；失擬項P=0.2926＞0.05，差異不顯著，表明該模型可以充分解釋響應中的變異，未知因素對試驗結果影響較小。該模型的確定系數R2=0.9771，調整系數0.9477，說明該模型能解釋94.77%響應值的變化，試驗誤差較小，擬合度較高，可以用此模型對蛋白水解度進行分析和預測。

表2響應面實驗模型方差分析

根據回歸模型系數顯著性檢驗結果，其中平方項A2、C2均小于0.01，B 2小于0.05，即發酵時間、發酵溫度具有極顯著的二次效應，酶用量有顯著的二次效應。交互項AB小于0.05，交互項AC、BC大于0.05，說明發酵時間和酶用量的交互作用顯著，發酵時間和發酵溫度、酶用量和發酵溫度的交互作用不顯著。

采用Design-Expert 11.1.0對試驗數據進行多元回歸擬合，得到的回歸方程如下：

水解度Y=-376.714+22.758A+0.717B+14.282C-0.0269AB-0.108AC+0.00316BC-0.642A2-0.00299B2-0.173C2（1）

2.3.2響應面分析與條件優化

模型（1）的響應面和等高線見圖4-圖6。

由圖4可知，發酵時間固定為12 h時，發酵溫度低于37℃，隨著酶用量的增加，水解度不斷增加，而當發酵溫度高于37℃，水解度基本處在一個較為平穩的狀態，增加酶用量對于水解度增加的效果不大。隨著發酵溫度的升高，水解度先增加后減少，當酶用量低于80 u/mL時，水解度的最大值受到一定限制并且最大水解度到來的較遲，當酶用量高于80 u/mL時，水解度達到最大的階段到來的較早。根據模型分析結果，發酵溫度和酶用量交互作用顯著。

由圖5可知，發酵溫度固定為37℃,水解度隨著酶用量的增加而呈現先增加后減少的趨勢，當酶用量為80 u/mL，水解度達到最大值，當發酵時間小于12 h時，酶用量的增加使水解度增加的效果不是很明顯，當發酵時間在12～14 h，水解度達到一個最大的階段，隨著酶用量的增加，水解度增加的幅度較小，基本處在一個較為平穩的狀態。根據模型分析結果，發酵時間和酶用量交互作用不顯著。

圖4蛋白酶用量B和發酵溫度C的響應面和等高線圖（A=12 h）

圖5發酵時間A和蛋白酶用量B的響應和等高線圖（c=37℃）

圖6發酵時間A和發酵溫度C的響應面和等高線圖（B=80 u/mL）

由圖6可知，當復合胰蛋白酶用量固定為80 u/mL時，隨著發酵溫度的上升，水解度呈現先上升后下降的趨勢，隨著發酵時間的延長，水解度也呈現先上升后下降的趨勢，當溫度低于37℃，下降趨勢明顯，當溫度高于37℃，水解度整體維持在一個較高水平，下降幅度較小。根據模型分析結果，發酵時間和發酵溫度的交互作用不顯著。

根據模型分析結果，發酵時間、復合胰蛋白酶用量、發酵溫度三個因素的影響作用由大到小排列順序依次為發酵溫度＞發酵時間＞酶用量。通過模型優化，得到的最佳水解度的發酵工藝參數為：發酵時間12.88 h，蛋白酶用量83.22 u/mL，發酵溫度38.89℃，此條件下理論蛋白水解度為71.44%。

為了檢驗響應面法優化實驗結果的可靠性，采用優化過的條件進行脫脂乳源益生菌水解蛋白的制備的重復實驗，考慮到實際情況，對工藝參數進行微調結果為：發酵時間13 h，蛋白酶用量83 u/mL,發酵溫度39℃。最終得到的實際蛋白水解度為72.21±2.12%，相對誤差為1.07%。因此，響應面法所得的優化條件參數可靠，該模型具有實用價值，可以為工業化益生菌水解蛋白粉的生產提供理論依據。

3結論

本實驗采用瑞士乳桿菌與蛋白酶結合的發酵方式，以脫脂乳為原料，以水解度為指標。通過比較不同蛋白酶與瑞士乳桿菌結合對增加脫脂乳源蛋白水解度的效果后，篩選出制備脫脂乳源水解蛋白的最佳蛋白酶為復合胰蛋白酶。

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Bohnken中心組合原理進行響應面優化，得到了蛋白水解度與發酵時間、酶用量和發酵溫度的回歸模型。研究結果表明：發酵溫度和蛋白酶用量的交互作用對蛋白水解度的影響為顯著（P＜0.05）。確定的最佳工藝參數為：發酵時間13 h，蛋白酶用量83 u/mL,發酵溫度39℃，此條件下蛋白水解度為72.21±2.12%。與原工藝單純用瑞士乳桿菌發酵相比，水解度提高50.90%。此研究結果為工業化發酵益生菌水解蛋白粉的生產提供了理論依據和指導。