中煙100根際土壤中ZJFLH3的解磷活性及生長特性

朱金峰 陳沖 陳啟龍

摘 要：采用平板分離技術，從中煙100煙草品種的根際土壤中分離獲得1株細菌，將該菌株編號為ZJFLH3。采用鉬藍比色法測定出ZJFLH3菌株經過62h發酵培養后上清液中的游離態磷含量明顯增加，濃度達到了128.3μg/mL，據此將ZJFLH3菌株初步定性為解磷活性功能菌株。經過對ZJFLH3菌株的生長條件初步測定，結果表明：ZJFLH3菌株的適宜生長的溫度范圍是25～35℃，最適溫度為30℃;適宜的pH值范圍是6～7，最適酸堿度環境為中性偏酸;適宜生長的鹽濃度范圍是0.15%～0.2%，高鹽不適宜菌株生長。ZJFLH3菌株可用作煙草菌肥、制劑開發的備用土著菌株。

關鍵詞：煙草;分離;解磷菌;生長特性

中圖分類號 S-3文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）04-0024-03

Abstract： A bacterial strain was isolated from rhizosphere soil of Chinese tobacco 100 by plate separation technique， and the strain was numbered as ZJFLH3. Molybdenum blue colorimetry was used to determine the content of free phosphorus in the supernatant of ZJFLH3 strain after 62 h fermentation culture，and the concentration reached 128.3 g/mL. Based on this， ZJFLH3 strain was preliminarily characterized as a functional strain with antiphosphorous activity. Furthermore， the growth characteristics of ZJFLH3 strain were preliminarily determined. The results showed that the suitable temperature range of ZJFLH3 strain was 25～35℃， and the optimum temperature was 30℃. The optimum pH range is 6～7，and the optimum pH environment is neutral acid. The range of salt concentration suitable for growth is 0.15%～0.2% and High salt is not suitable for strain growth. ZJFLH3 strain can be used as an alternative indigenous strain for tobacco fertilizer and preparation development.

Key words： Tobacco; Isolation; Dephosphorization bacteria; Growth characteristics

磷是作物正常生長發育所必需的礦質元素之一，是植物體內核酸、多種酶類、三磷酸腺苷等的重要組成部分。作物缺磷時，常表現為生長緩慢、分枝少、矮小瘦弱;葉片易脫落，色澤呈暗綠或灰綠色，并常出現紫紅色;植物根系發育受阻，成熟推遲，產量和品質均顯著降低[1-3]。土壤中含有大量的磷元素，但磷多以有機和無機的高分子化合態存在，植物并不能直接吸收利用。我國約有74%的耕地天然缺磷，在作物發育周期中及時足量補充磷肥尤為重要[4，5]。在磷肥的開發和應用實踐中，除了傳統化學磷肥的廣泛使用之外，生物磷肥逐漸得到重視和應用，其理論基礎是土壤中的磷素循環以微生物活動為中心，微生物的活動對土壤磷的轉化和有效性影響很大[2，5]。研究表明[6-8]，土壤中存在大量的具有解磷功能的微生物，其可以將植物難以吸收利用的難溶性磷轉化為可吸收利用的可溶性磷。因此，開展解磷菌的篩選、鑒定、活性評估及功能菌株的生長特性研究，對開發生物磷肥具有重要意義。本研究以煙草根際土壤為材料，對解磷菌進行了篩選、活性測定及生物學特性研究等，以期豐富生物磷肥開發的野生土著微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 土壤樣品采自漯河市煙草公司煙草生產田，煙草品種是中煙100。解磷菌平板分離培養基：葡萄糖5g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.3g，七水硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，四水硫酸錳0.03g，磷酸鈣8g，瓊脂粉20g，pH7.0。發酵培養基：葡萄糖5g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.3g，七水硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，四水硫酸錳0.03g，磷酸鈣8g，pH7.0。活化培養基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，pH7.2。基礎培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選 稱取中煙100煙草根際土樣5g，加入已滅菌的盛有45mL無菌水的三角瓶中。震蕩混勻30min，然后靜置30s，此混懸液認定為10-1濃度的土壤稀釋母液。再按10倍梯度稀釋法在無菌操作條件下依次稀釋至10-6濃度。試驗分別選取10-4、10-5和10-6 3個梯度稀釋液，并分別吸取0.1mL涂布于解磷菌平板分離培養基，于28℃恒溫培養4 d。選取生長良好、特征典型、解磷圈明顯的單菌落進行連續3次的劃線純化，獲得目標菌株。

1.2.2 目標菌株解磷活性的定量測定 將分離獲得的具有解磷活性菌株采用鉬藍比色法測定解磷能力，操作步驟參考文獻進行[9]。

1.2.3 影響目標菌株生長的因素 溫度：首先將目標菌株在活化培養基中活化（菌懸液OD600=0.2），以0.1%的接種量接入基礎培養基中，并分別在15、20、25、30、35、40和45℃溫度梯度下，180r/min震蕩培養12h，分光光度計測定600nm處的OD值。3次重復取平均值，下同。pH：首先將目標菌株在活化培養基中活化（菌懸液OD600=0.2），以0.1%的接種量接入調配好pH值的基礎培養基中，培養基的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9和10，180r/min條件下震蕩培養12h，分光光度計測定600nm處的OD值。NaCl：首先將目標菌株在活化培養基中活化（菌懸液OD600=0.2），以0.1%的接種量接入調配好NaCl含量的基礎培養基中，NaCl含量（W/V）分別為0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、1%、2%、3%和4%，180r/min條件下震蕩培養12h，分光光度計測定600nm處的OD值。

2 結果與分析

2.1 獲得菌株 試驗通過解磷菌平板分離培養，獲得3株具有明顯解磷圈的菌株，其中解磷圈最大的菌株單菌落呈淡黃色，菌落較大，邊緣整齊，在培養基表面微凸，半濕潤（圖1），初步定性為具有解磷活性的目標菌株，并將其編號為ZJFLH3。

2.2 ZJFLH3的解磷活性 采用鉬藍比色法，對分離獲得的菌株ZJFLH3的解磷活性進行定量測定，結果表明，目標菌株ZJFLH3經過連續74h發酵，發酵液培養基上清液中游離態磷含量存在動態變化，發酵的前50h，游離態磷含量隨時間延長而不斷增大，發酵50h時達到最大值141.6μg/mL;發酵50h以后，游離態磷含量略有下降。而空白對照始終都未檢測到游離態磷含量的變化，進一步說明目標菌株ZJFLH3具有解磷功能（圖2）。

2.3 影響ZJFLH3的生長因素

2.3.1 溫度 由圖3可知，菌株ZJFLH3在20℃以下時OD值較小，說明菌株生長較為緩慢，高于20℃時，OD值增長幅度迅速增大，至30℃時到達最大值;30℃以上溫度條件下OD值開始變小，說明菌株生長變慢，至35℃時，OD值開始迅速下降。整體而言，菌株ZJFLH3在25～35℃溫度范圍時生長良好，最適生長溫度可確定為30℃。

2.3.2 酸堿度 菌株ZJFLH3在pH值小于5或大于8時均表現出極低生長速度;pH大于5.0時，生長速度迅速增加，至7.0時OD值達到最大值，大于7.0時，OD值下降迅速，整體而言，說明菌株ZJFLH3適宜于在中性偏酸性環境生長，在堿性環境生長速度受到明顯抑制;當pH小于5或和大于8時，OD值都處于極低水平，說明強酸和強堿環境均不適合菌株生長。故菌株生長的適宜pH值范圍認定為6～7，最適酸堿度環境為中性偏酸（圖3）。

2.3.3 鹽濃度 由圖5可知，當NaCl含量介于0.15%～0.2%范圍時，OD值均處于較高水平，變化幅度較小，說明此濃度范圍適宜菌株ZJFLH3生長;當大于0.2%時，OD值下降迅速，當大于1%時，OD值開始維持在較低水平，說明不利于菌株生長;NaCl含量在0～0.1%范圍內，OD值隨濃度的提高而增大。整體而言，菌株ZJFLH3生長的適宜鹽濃度范圍是0.15%～0.2%，高鹽不利于菌株生長。

3 討論

土壤中的解磷微生物既有可以對有機磷進行降解礦化作用的類群，也有將無機固定態磷轉化為可溶性磷的種類，故根據解磷菌作用對象的不同，可將解磷菌分為有機磷微生物和無機磷微生物[2-6]。本研究通過無機磷平板分離培養基分離獲得的菌株ZJFLH3，形成的溶解圈明顯。經過對連續發酵上清液中和培養基上清液中游離態磷含量的動態檢測表明，游離態磷含量顯著增加，且最大濃度達到了128.3μg/mL，因而可將菌株ZJFLH3定性為具有解磷功能菌株，可作為煙草生物磷肥開發研究的備用菌株資源。本研究還考察了溫度、酸堿和鹽濃度對菌株ZJFLH3生長發育的影響，該菌株適宜生長溫度為25～35℃，適宜酸堿度為6～7，適宜鹽濃度為0.15%～0.2%。

大量研究表明[10-12]，土著功能菌株天然的功能活性往往較低，很多菌株達不到直接開發成商品的條件，通過誘變育種提高功能菌株的功能活性，是后期研究的重點內容之一。因此，后續工作將開展對菌株ZJFLH3的誘變育種，提高解磷活性，并優化其發酵條件，為菌株ZJFLH3的開發用于提供更加充分的條件。

參考文獻

[1]吳向華，劉五星.土壤微生物生態工程[M].北京：化學工業出版社，2012，72-75.

[2]李海云，孔維寶，達文燕，等.土壤溶磷微生物研究進展[J].生物學通報，2013，48（7）：1-5.

[3]刁治民，周富強，高曉杰，等.農業微生物生態學[M].成都：西南交通大學出版社，2008，229-230.

[4]趙小蓉，林啟美.微生物解磷的研究進展[J].土壤肥料，2001，3：7-11.

[5]孫桂芳，金繼云，石元亮.土壤磷素形態及其生物有效性研究進展[J].中國土壤與肥料，2011，2：1-9.

[6]席琳喬，馮瑞章.植物根際解磷菌的研究進展[J].塔里木大學學報，2006，18（4）：57-61.

[7]鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學報，2005，42（2）：286-294.

[8]王俊宏，張蕊，王夢亮.解磷微生物在農業上的應用[J].山西農業科學，2010，38（9）：86-88.

[9]許光輝，鄭洪光.土壤微生物分析方法手冊[M].北京：農業出版社，1986：168-171.

[10]龔文秀，曹媛媛，倪海婷，等.煙草親和性解鉀PGPR菌株篩選及其促生效果研究[J].中國煙草學報，2016，22（1）：55-63.

[11]蔣詠梅.微生物育種學實驗[M].北京：科學出版社，2012，117-211.

[12]張樹飛，鄔敏辰.酸性β-甘露聚糖酶高產菌株的誘變育種[J].農業生物技術學報，2008，16（2）：346-350.

（責編：王慧晴）