山荔枝酒精飲料發酵工藝優化及抗氧化活性研究

高豐衣，劉啟輝，李敏波，蔡圣寶，易俊潔*

（1.商丘師范學院生物與食品學院，河南商丘 476000；2.昆明理工大學農業與食品學院，云南昆明 650500）

山荔枝（Dendrobenthamia japonica var.chinensis）也叫野荔枝，主要分布于中國的云南、四川、西藏等省份，以及印度、巴基斯坦、尼泊爾等地區[1]。山荔枝具有很高的藥用價值，有通經、暖胃、活血等功效[2]，研究表明山荔枝營養成分豐富，含有19 種游離氨基酸，20 種水解氨基酸，VC 含量為24.5 mg/100 g，蛋白質占0.49%，總糖占6.25%[3]。另有文獻報道，山荔枝中含有三萜、雙環烯醚萜苷、環烯醚萜苷、多酚類、有機酸類、甾醇、單萜苷、黃酮類、多糖類等多種功能性成分[4-7]。多酚類物質是荔枝植物含量豐富的活性成分之一[8-9]，其總酚含量約為101.51～259.18 mg GAE/100 g[10]。李春陽等[11]研究表明，原花青素等酚類物質，具有顯著的抗氧化，清除超氧陰離子自由基、羥基自由基，減少脂質過氧化自由基等作用。自由基是導致細胞和組織損傷、致病的重要原子或基團，也是參與機體氧化的重要物質[12-13]。蔣本慶等[14]研究發現水果經過發酵獲得的果酒含有更豐富的抗氧化物質，適量飲用可促進血液循環和機體新陳代謝，對清除體內自由基具有積極的作用。

目前，市場上以山荔枝為主要原料的產品較少，尤其是經過發酵的功能性酒精飲料則更少，因此開發高營養價值、高品質的山荔枝發酵酒精飲料具有重要的意義。但在實際生產過程中，酒精飲料常存在穩定性差、澄清度低、易渾濁等問題，嚴重影響了飲料的品質和飲料的產業發展。基于此，本試驗以山荔枝為主要原料進行發酵，通過正交試驗獲得最佳發酵工藝，并對比分析了四種澄清劑對山荔枝酒精飲料的澄清效果，最后對澄清工藝優化后的山荔枝酒精飲料的多酚組成和抗氧化活性進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山荔枝購于云南省西雙版納地區，冷凍備用；釀酒酵母2323，購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、福林酚（分析純），均購于Merck 公司；蔗糖、氫氧化鈉、鹽酸、3,5-二硝基水楊酸、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、結晶酚、無水亞硫酸鈉均為分析純，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

Spectra Max M5 型多功能酶標儀，美國Molecular Devices；BSA124S-CW 型電子精密天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Dionex U3000 超高效液相色譜，賽默飛世爾科技（美國）有限公司；Q-Exactive 高分辨軌道離子阱質譜，賽默飛世爾科技（德國）有限公司;JN-5200DTS 型超聲，寧波市科技園區新江南儀器有限公司；真空泵，德國Vacuubrand；HH-4 數顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；BSA124S-CW 型電子精密天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BSC-250 型恒溫恒濕培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；UPHW-I-90T 型優普超純水制造系統，成都超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山荔枝酒精飲料發酵工藝

冷凍山荔枝→解凍→榨汁→調整成分（糖度）→接種活化酵母→發酵→過濾→澄清→陳釀→貯存

1.3.2 操作要點

（1）榨汁

選擇完整、成熟的冷凍山荔枝，解凍后進行榨汁。

（2）活化酵母

準備100 mL、0.05 g/mL 的蔗糖溶液，置于38 ℃水浴中，待溫度恒定，加入10 g 釀酒酵母，恒溫活化30 min，活化過程中會有氣泡產生，每隔10 min 用玻璃棒攪拌一次，至不產生氣泡為止。

（3）接種活化酵母

將酵母活化液的溫度降至發酵溫度，將山荔枝汁加熱至發酵溫度，按照試驗要求的量添加酵母活化液。

1.3.3 釀造工藝條件的確定

（1）發酵溫度對山荔枝酒精飲料品質的影響

將發酵液糖度調整到180 g/L，向其中添加0.6%的酵母活化液，分別在18、21、24、27 ℃下進行發酵，以感官評定獲得的綜合評分為指標，結合酒精度和還原糖濃度，確定最適發酵溫度。

（2）蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響

分別將發酵液的初始糖度調整到150、180、210、240 g/L，向其中添加0.6%的酵母活化液，在24 ℃下進行發酵，以綜合評分為指標，結合酒精度和還原糖濃度確定最適蔗糖添加量。

（3）酵母添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響

將發酵液的初始糖度調整到180 g/L，分別向發酵液中添加質量分數為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的酵母活化液，在24 ℃條件下進行發酵，以綜合評分為指標，結合酒精度和還原糖濃度確定最適酵母添加量。

（4）正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上進行L9(34)正交試驗。以綜合評分為主要指標確定最佳發酵工藝，正交試驗設計的因素水平表如表1 所示。

表1 影響發酵工藝的因素水平表Table 1 Impact factors and level of fermentation process

1.3.4 澄清工藝優化

選用4 種澄清劑：果膠酶、硅藻土、殼聚糖、明膠。

澄清方法如下：取10 mL 試管5 只，加入5 mL 自制山荔枝酒精飲料，再加入澄清劑0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，充分混勻并靜置24 h，記錄現象，取其上清液在960 nm 處測其吸光值，并重復3 次。

1.3.5 理化指標的測定

（1）固形物含量

采用臺式阿貝折光儀進行測定。

（2）酒精度

采用GB/T 15038 2006 葡萄酒、飲料分析通用方法中的酒精計法進行測定[15]。

（3）還原糖含量

發酵液體中還原糖的測定參考王鵬等[16]、黃進[17]的方法，略作修改。發酵液過濾，取1 mL 濾液定容至50 mL。然后取1 mL 于25 mL 的比色管中，加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至10 mL，搖勻，540 nm 處測吸光度。

1.3.6 感官評價

發酵結束后，由5 名經過訓練的感官品評員對酒體的色澤、香氣、狀態等進行感官評價，總分100 分。感官評分標準見表2。

表2 感官評分表Table 2 Sensory assessment criteria

1.3.7 多酚含量測定

樣品前處理：從自制山荔枝酒精飲料樣液中取3 mL樣品，在離心機中以10 000 r/min 離心10 min，取上清液，經0.22 μL 微孔濾膜過濾備用。

色譜柱：Thermo Fisher C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）。色譜條件：流動相A-0.1%甲酸水，B-乙腈。梯度洗脫程序如下：0～5 min，5%B；5～10 min，20%B；10～12 min，22%B；12～15 min，25%B；15～20 min，5%B。進樣量：2 μL，流速：0.2 mL/min，柱溫：35 ℃。

質譜條件：電離模式采用SEI 負離子檢測模式，碰撞氣體為高純度氦氣（He），霧化氣體為高純度氮氣（N2），鞘氣流速：30 L/min；輔助氣流速：8 L/min；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：320 ℃；噴霧電壓：3.2 kV；質量掃描范圍m/z：120～1 000。

1.3.8 DPPH·自由基清除能力測定

精確稱取DPPH·粉末0.039 4 g，用甲醇溶解，并定容至100 mL，配制成1 mmol/L DPPH·母液。測定時，用甲醇稀釋10 倍，配制成0.1 mmol/L DPPH·反應液。取0.5 mL 稀釋為一定濃度梯度的樣品溶液于離心管中，加入2.0 mL、0.1 mmol/L DPPH·反應液混合均勻。將混合反應液置于暗處并不斷振蕩30 min，于517 nm 下測定其吸光值。空白對照組用水代替樣品溶液，樣品的DPPH·自由基清除能力按式（1）進行計算。

式中，A0為對照組吸光值，Ax0為樣品對照組吸光值，Ax為樣品吸光值。

1.4 數據統計分析

所有試驗操作均重復測定3 次，結果表示為“平均值±標準偏差”，所有結果均利用單因素方差分析（oneway ANOVA）進行顯著性分析，采用Tukey 檢測，統計學分析和作圖均在Origin 8.5 軟件中完成。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對山荔枝酒精飲料品質的影響

表3 發酵溫度對山荔枝酒精飲料品質的影響Table 3 Effect of fermentation temperature on quality of litchi alcohol beverage

發酵溫度的控制對于發酵過程尤為重要。溫度對于酵母細胞的酒精發酵及蘋果酸分解有很大影響。溫度過高時會使酵母代謝過于旺盛[18]，增殖速度變快，使細胞逐漸出現衰老，造成提前老化，發酵停止較早，最終生產的酒精濃度較低，妨礙荔枝酒精飲料色、香、風味的形成，還易造成雜菌滋生，不利于發酵的順利進行；溫度較低時，發酵速度慢，但不易衰老，發酵持續時間長，發酵徹底，最終生產的酒精濃度高。由表3 可知，隨著發酵溫度的升高，山荔枝酒精飲料的糖度下降，而酒精度呈上升趨勢，當發酵溫度為18 ℃時，其還原糖含量較高。這可能是由于溫度較低不利于酵母繁殖和代謝，沒有足夠的微生物來進行發酵，導致其酒精度低，山荔枝酒精飲料缺少酒香氣，從而影響其綜合評分。當發酵溫度為27 ℃時，其還原糖含量最低，但酒精度并非最高，這可能是由于溫度較高，發酵速度快，細胞易衰老，發酵不徹底，最終產生的酒精濃度較低。根據綜合評分，最適發酵溫度選擇24 ℃。

2.1.2 蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響

表4 蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響Table 4 Effect of sucrose content on the quality of litchi alcohol beverage

表4 顯示了蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響。由表可知，隨著蔗糖添加量的提高，山荔枝酒精飲料的酒精度以及還原糖含量也隨之上升。在初始糖度為150 g/L 時，其酒精度太低，酒香氣寡淡[19]，綜合評分最低。初始糖度為210 g/L 時，發酵比較平穩，還原糖含量在80 μg/mL 附近波動，綜合評分最高。初始糖濃度為240 g/L 時，其酒精度最高，但可能由于口感過甜，酒香氣太過濃郁，評分并沒有達到最高。根據綜合評分，最適的蔗糖添加量為210 g/L。

2.1.3 酵母添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響

由表5 可知，酵母添加量對發酵有一定影響，酵母添加量的高低直接影響山荔枝酒精飲料的色、香和風味。當酵母添加量為0.4%時，接種量過低，發酵緩慢且不徹底，導致還原糖濃度和酒精含量較低。當酵母添加量為0.6%時，山荔枝酒精飲料發酵適當，酒精度最高。當酵母添加量為1%時，還原糖含量高但酒精度增幅較小，這可能是由于酵母增殖速度過快，細胞過早老化，沒有代謝完全。在整個發酵過程中，釀酒酵母增殖與還原糖含量和酒精度增加呈一定的比例關系的[20]。接種量過高時，發酵速度過快，不利于風味形成，且山荔枝原酒的酵母味較重，給后續的澄清及調配工藝造成不良影響；接種量過低時，發酵緩慢，發酵時間延長，易于雜菌的生長，也會影響山荔枝酒精飲料的風味。根據綜合評分并結合酒精度和還原糖含量選出酵母最優添加量為0.6%。

表5 酵母添加量對山荔枝酒精飲料品質的影響Table 5 Effect of yeast addition on quality of litchi alcoholic beverage

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以發酵溫度、初始糖度、酵母接種量為試驗因素，以綜合評分為主要指標，進行L9(34)正交試驗，結果見表6。

表6 發酵工藝的正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results of fermentation process

由表6 可知，對山荔枝酒精飲料的品質影響主次順序為A＞B＞C，即影響最大的是發酵溫度，其次是酵母接種量，初始糖度的影響最小。根據綜合評分可以得出發酵最佳組合為A3B3C1，即發酵溫度27 ℃，酵母接種量0.8%，初始糖度180 g/L。對正交試驗結果進行驗證，該工藝加工的山荔枝酒精飲料，所得酒體澄清，色澤均勻一致，典型突出，具有山荔枝獨特的清香味，感官評價綜合評分為89 分，優于其他組合。

2.3 澄清工藝優化

不同澄清劑對山荔枝酒精飲料的澄清效果如圖1 所示。

2.3.1 殼聚糖對山荔枝酒精飲料的澄清效果

由圖1 可以看出，殼聚糖對山荔枝酒精飲料具有很好的澄清效果，當用量在10 g/L 時，澄清效果最好，此時透光率達到91.40%±0.95%。殼聚糖對山荔枝酒精飲料有較好的絮凝澄清效果，是因為在酸性介質中，殼聚糖的游離氨基（NH2）與質子H+結合，成為帶正電荷的高分子物質，而飲料中含有大量帶負電荷的果膠、纖維素、單寧及多聚戊糖等微小顆粒，當兩者混合后，依靠靜電作用，飲料中的微小顆粒很快纏繞于有線性分子結構的殼聚糖上，使微小顆粒變成大顆粒，進而逐漸沉降，使飲料澄清透明[21]。

2.3.2 果膠酶對山荔枝酒精飲料的澄清效果

圖1 顯示果膠酶的用量在6 g/L 時，山荔枝酒精飲料透光率較高，達到95.00%±2.23%，這可能是由于果膠酶能水解飲料中果膠等多糖物質，使之失去穩定性，不溶性大分子物質和果肉微粒失去膠體保護作用而發生共聚沉淀，因此增加了飲料的透光率[22]。果膠酶用量在6 g/L與8 g/L 時差異不顯著（P＞0.05），增加至10 g/L 時呈現下降趨勢，這可能是因為果膠降解所得的低分子物質改變了酒中的pH 值，從而影響了果膠酶的澄清效應，造成澄清度的降低[23]。

2.3.3 明膠對山荔枝酒精飲料的澄清效果

當明膠用量達到8 g/L 時透光率達到33.21%±1.17%，此時的澄清效果最好（如圖1 所示）。隨著明膠添加量的增大，山荔枝酒精飲料的透光率呈現先增大后減小的趨勢，這可能是由于山荔枝酒精飲料中含有豐富的單寧類物質，而明膠屬于蛋白質類，可與飲料中的單寧形成蛋白質-單寧絡合物，隨著絡合物的增多，吸附在酒中的懸浮物將會聚沉，從而達到澄清效果[24]。當明膠用量超過8 g/L 時，由于單寧物質不足，過量的明膠形成懸浮物，導致透光率下降。

2.3.4 硅藻土對山荔枝酒精飲料的澄清效果

由圖1 可知，隨著硅藻土添加量的增加，山荔枝酒精飲料的透光率先增加后下降，這是因為硅藻土將酵母沉淀于容器的底部，經過一段時間后，酵母繁殖生長，同時進行發酵過程，釋放CO2和酒精，CO2堆積形成氣泡并向上運動，將沉淀攪起，導致澄清度降低和不穩定[25]，因此硅藻土溶液的用量超過8 g/L 時，樣品透光率降低。

綜上所述，當澄清劑添加量≤8 g/L 時，不同澄清劑對山荔枝酒精飲料澄清效果的整體影響趨勢相似，即隨著添加濃度的升高，澄清效果越顯著。對比四種澄清劑，發現殼聚糖和果膠酶的澄清效果顯著優于明膠和硅藻土（P＜0.05），尤其是果膠酶。在低添加濃度時，果膠酶澄清效果最優，但隨著添加濃度增大，殼聚糖和果膠酶之間的澄清效果差異逐漸減小。當殼聚糖和果膠酶的添加量達到8 g/L 和10 g/L 時，兩種澄清劑處理的山荔枝酒精飲料的透光度之間無顯著性差異（P＞0.05）。通過綜合用量和飲料的透光率，對比分析4 種澄清劑的澄清效果，可以看出其效果呈現出果膠酶＞殼聚糖＞硅藻土＞明膠的趨勢。果膠酶在較低用量，即添加6 g/L 時，山荔枝酒精飲料透光率達到最高。因此，選取果膠酶作為山荔枝酒精飲料的澄清劑。

2.4 山荔枝酒精飲料中的酚類物質及抗氧化活性分析

2.4.1 酚類物質

通過優化工藝后（發酵溫度27 ℃，酵母接種量0.8%，初始糖度180 g/L，以果膠酶為澄清劑），對生產出的山荔枝酒精飲料的總酚、總黃酮含量進一步測定。根據上述試驗方法中測出的沒食子酸標準曲線，算出總酚的含量90.74±0.23 μg/mL，以蘆丁作為標準曲線，計算飲料中的黃酮含量24.66±0.08 μg/mL。

通過LC-MS 分析，得到山荔枝酒精飲料中酚類物質在負離子模式下的總離子流圖（如圖2 所示）。結合已有文獻對酚類物質的研究結果，并根據總離子流圖中對應的保留時間/質荷比以及二級碎片離子對飲料中酚類物質進行鑒定，共推斷出7 種主要成分（如表7 所示），包括奎寧酸、水楊酸己糖苷、咖啡酰己糖苷、單咖啡酰奎尼酸、香橙苷、對香豆酸等。

表7 山荔枝酒精飲料中主要成分的LC-MS 鑒定Table 7 Identification of main components of litchi alcoholic beverage by LC-MS

2.4.2 DPPH·自由基清除能力

山荔枝酒精飲料的DPPH·自由基清除活性結果如圖3 所示。由圖3 可以看出，飲料對DPPH·自由基具有較好的清除能力，并且呈現量效關系。隨著樣品濃度升高，其DPPH·自由基清除活性能力也隨之升高，但升高程度逐漸降低，如樣品濃度在20～80 μg/mL 之間，清除率變化幅度已很小，說明此濃度下飲料中的DPPH·自由基基本上已經被清除，在80 μg/mL 時清除率達到最大，為90.3%±0.22%，這與Kaustav 等[26]的試驗結果相似，荔枝飲料DPPH·自由基清除率可達到86.7%±0.17%。本研究結果證明山荔枝酒精飲料具有很好的DPPH·自由基清除活性，可以用來清除人體內過多的自由基，從而避免人體組織器官受到自由基的氧化損傷。

3 結論

本文以云南山荔枝為試驗原料，研究了山荔枝低酒精度飲料的發酵工藝、澄清工藝，以及飲料中總酚、總黃酮含量、酚類物質的組成及其抗氧化性。結果表明，最佳發酵工藝條件為初始糖度180 g/L，發酵溫度27 ℃，酵母接種量0.8%，最優的澄清劑為果膠酶（果膠酶濃度為6 g/L時，其透光率可達到95%）。通過測定總酚、總黃酮含量及分析多酚組分發現，山荔枝酒精飲料中多酚含量為90.74 μg/mL，黃酮含量為24.66 μg/mL，主要多酚組分包括水楊酸己糖苷、咖啡酰己糖苷、單咖啡酰奎尼酸、香橙苷、對香豆酸、木犀草素、槲皮苷等7 種。同時，山荔枝酒精飲料對DPPH·自由基具有較好的清除能力，在較低濃度條件下對DPPH 的清除率可達到80%以上。

綜上所述，開發以山荔枝為主要原料的發酵低酒精度的飲料，不僅可以豐富云南特色山荔枝產品的種類，而且還能夠開發出具有較高抗氧化功能特性的果酒飲料，對推動地方產業發展、提升消費者健康具有重要的意義。