反相高效液相色譜法測(cè)定薺菜中的維生素C

吳海燕 ，張新宇，陳建軍，唐明霞，邱衛(wèi)池，程玉靜，袁春新*

（1.南通科技職業(yè)學(xué)院，江蘇南通 226007；2.南通市農(nóng)村專(zhuān)業(yè)技術(shù)協(xié)會(huì)，江蘇南通 226006；3.南通市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，江蘇南通 226018；4.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226541；5.江蘇中寶食品有限公司，江蘇海門(mén) 226200）

維生素C（VC）是維持人體正常生理代謝必需的一類(lèi)有機(jī)化合物，具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化等生理作用[1-2]，但人體內(nèi)不能合成VC，必須由食物供給。薺菜（Capsella bursa-pastoris.）是十字花科植物，在我國(guó)分布廣泛。作為一種藥食同源植物，薺菜富含維生素、黃酮、多糖、多酚等生物活性成分[3-4]，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。

VC 具有強(qiáng)還原性，在空氣中非常容易氧化，對(duì)熱敏感。薺菜預(yù)處理過(guò)程中，由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，容易使樣品中的VC 損失，從而影響樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度和精確度。傳統(tǒng)的VC 提取是將樣品在酸溶液中破碎，常溫下浸提[5-7]，提取時(shí)間長(zhǎng)，VC 容易受環(huán)境影響而損失。超聲波提取是利用超聲波的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、擾動(dòng)效應(yīng)，增加溶劑的穿透力，加速溶劑對(duì)目標(biāo)提取物的提取進(jìn)程，縮短提取時(shí)間。與傳統(tǒng)的提取法相比，超聲波提取法最大優(yōu)點(diǎn)是提取時(shí)間縮短，目標(biāo)提取物的損失降低[8]。目前超聲波提取技術(shù)已逐漸應(yīng)用于天然植物有效成分、生物活性成分的提取研究中[4,9-10]。VC 含量的測(cè)定方法一般包括滴定法、比色法、電化學(xué)法、熒光法等，這些方法所需試劑較多，操作繁瑣，影響測(cè)定效率。而高效液相色譜法由于其高效、穩(wěn)定、可靠等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于果蔬中維生素C含量的測(cè)定[5]，特別是在分析大批量樣品時(shí)，借助儀器的分析方法能更快更準(zhǔn)確地進(jìn)行含量測(cè)定。本研究建立了超聲波提取薺菜中的VC，反相高效液相色譜測(cè)定VC 含量的方法，為薺菜等蔬菜中維生素C 含量的測(cè)定提供了試驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薺菜，江蘇中寶食品有限公司提供。

甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；VC，純度≥99.0%，Sigma 公司；草酸等試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；0.45 μm 濾膜，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 高效液相色譜儀，Waters1525 泵，Waters2489雙通道紫外檢測(cè)器；Breeze 色譜系統(tǒng)管理工作站，色譜柱：Fortis-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；液相平頭微量進(jìn)樣器（25 μL）Eppendorf；HR2084 食品制樣器，飛利浦公司；隔膜真空泵，天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠；UV-1801紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司；KQ2200 超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平（精確度0.1 mg），Sartorius 公司；高速冷凍離心機(jī)（SL 8R），Thermo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)量20.0 mgVC 標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%的草酸溶解，定容于100 mL 棕色容量瓶中，制成VC 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，低溫避光保存。量取5.00 mLVC 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%的草酸定容于50 mL 棕色容量瓶中，制成VC 標(biāo)準(zhǔn)工作液。再分別準(zhǔn)確取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 的VC 標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.1%的草酸定容，制成濃度為2～20 μg/mL 的VC 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)溶液。

1.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

以0.1%的草酸溶液作為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在230～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描測(cè)定VC 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液（2～10 μg/mL）的吸光度，依據(jù)最大吸收波長(zhǎng)選擇試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.3 樣品超聲提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g 去除黃葉的薺菜樣品置于食品制樣器中，加入100 mL 的1%草酸溶液，勻漿。準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g 勻漿樣品放入50 mL 的離心管中，加入2%草酸40 mL，置于超聲波儀中提取，100 W 功率，25 ℃超聲提取10 min；4 ℃、9 000 r/min 離心，上清液用0.1%的草酸溶液轉(zhuǎn)移定容至50 mL 的棕色容量瓶中，制成待測(cè)液。待測(cè)液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC 測(cè)定。

1.3.4 色譜分析

以Fortis-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）為固定相，以0.1%的草酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：25 μL，柱溫：25 ℃，采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；待液相色譜基線穩(wěn)定后進(jìn)樣分析，以保留時(shí)間定性，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.3.5 線性關(guān)系分析

濃度為2～20 μg/mL 的VC 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，按1.3.4 色譜條件進(jìn)行HPLC 測(cè)定。每個(gè)濃度進(jìn)樣3 次，以峰面積積分平均值為縱坐標(biāo)，以VC 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的薺菜樣品6 份，按照1.3.3 的方法處理樣品，每個(gè)樣品按照1.3.4 的色譜條件進(jìn)行3 次，取峰面積積分平均值，求出6 份樣品中薺菜的含量，計(jì)算檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.3.7 回收率試驗(yàn)

采用加標(biāo)回收法，精密稱(chēng)取勻漿樣品適量，加入VC標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.3 方法進(jìn)行處理，每個(gè)樣品按照1.3.4 的色譜條件測(cè)定3 次，取峰面積積分平均值，求VC 的含量，計(jì)算出檢測(cè)方法的回收率。

1.3.8 檢出限與定量限

以產(chǎn)生3 倍儀器噪聲水平的進(jìn)樣量為檢出限，以產(chǎn)生10 倍儀器噪聲水平的進(jìn)樣量為定量限[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用紫外分光光度計(jì)掃描測(cè)定維生素C 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液（2～10 μg/mL）的吸光度如圖1 所示。由圖1 可知，不同濃度VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)在245 nm 左右，并且隨著VC 標(biāo)準(zhǔn)濃度的增加，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度也增加。研究表明，在最大吸收波長(zhǎng)±2 nm 的波長(zhǎng)都可以作為檢測(cè)波長(zhǎng)[11]，因此波長(zhǎng)在243～247 nm 都可作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本研究中選擇246 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜分離結(jié)果

色譜分離效果的主要影響因素為色譜柱的類(lèi)別、流動(dòng)相的種類(lèi)和流動(dòng)相的流速。在1.3.4 色譜條件下，VC 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、薺菜提取液的色譜圖如圖2、3 所示，樣品中VC 實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形滿足測(cè)定要求，VC 的保留時(shí)間為6.476 min，檢測(cè)限為0.3 μg/mL，定量限為1 μg/mL。樣品中VC 含量≥0.6 mg/100 g 可以定性；樣品中VC 含量≥2 mg/100 g 可以定量。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以3 次進(jìn)樣的平均峰面積為響應(yīng)值，以VC 標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度（μg/mL）為自變量，求直線回歸方程為：y=75 480.2x-930.2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，樣品中VC 的濃度在2～20 μg/mL 范圍內(nèi)，色譜峰峰面積與VC 的濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

同一批次薺菜峰面積的平均值，帶入回歸曲線求出VC 含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，薺菜中VC 含量為56.05 g/100 g，RSD 為1.97%，表明采取超聲波輔助提取，反相高效液相色譜測(cè)定薺菜中VC 含量的方法重現(xiàn)性較好。

2.5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of recovery test

回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，由表2 可知，添加量為10 mg/100 g 的樣品，平均回收率為101.48%，RSD 值為1.84%；添加量為20 mg/100 g 的樣品，平均回收率為99.73%，RSD 值為1.83%；添加量為40 mg/100 g 的樣品，平均回收率為100.06%，RSD 值為0.35%，表明采用超聲波提取、反相高效液相色譜法測(cè)定薺菜中VC 含量的方法準(zhǔn)確可靠，符合色譜定量分析準(zhǔn)確度的要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取，過(guò)濾后用反相高效液相色譜來(lái)測(cè)定薺菜中的VC 含量。反相高效液相色譜測(cè)定VC 的方法線性范圍為2～20 μg/mL，平均回收率為99.73%～101.48%，重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97%。方法檢出薺菜中VC 含量的檢出限為0.6 mg/100 g，定量限為2 mg/100 g，薺菜中VC 含量為56.05 g/100 g。VC 性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化分解，采用超聲波輔助提取，能加快提取進(jìn)程，避免VC 損失；同時(shí)使樣品中的VC 易提取，測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度好，可以用于蔬菜中VC 含量的定量測(cè)定。