不同部位庫(kù)拉索蘆薈的抗氧化酶活性

王 斌，趙金榮，張騰霄，郭妍瑤，齊 琦

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

庫(kù)拉索蘆薈(AloebarbadensisMiller)是百合科多年生常綠肉質(zhì)植物，素有“天然美容師”、“家庭醫(yī)生”的美稱，收錄于2015版《中國(guó)藥典》(一部)，被廣泛用于護(hù)膚化妝品、保健食品及消化道潰瘍、便秘、糖尿病、心腦血管疾病、婦科病、皮膚病、癌癥的治療[2-3]。蒽醌和多糖是庫(kù)拉索蘆薈中最主要的功能性成分，此外，還含有多種消除超氧化物自由基的抗氧化成分，如超氧化物岐化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)等抗氧化酶，這些抗氧化成分具有防皺、延緩衰老、保護(hù)紅細(xì)胞等作用。研究表明，SOD在治療高血壓、糖尿病、癌癥等研究領(lǐng)域均有應(yīng)用。目前，研究庫(kù)拉索蘆薈中蒽醌和多糖成分較多，研究其抗氧化酶活性相對(duì)較少。為此，筆者等通過(guò)對(duì)比不同部位庫(kù)拉索蘆薈抗氧化酶活性，以期為其在保健品、化妝品方面的開(kāi)發(fā)與利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

庫(kù)拉索蘆薈：6年生植株，于2019年9月采于黑龍江省綏化市農(nóng)戶種植，經(jīng)綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院鑒定為庫(kù)拉索蘆薈(AloebarbadensisMiller)。

儀器：FA2104電子天平，上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司；YH-A6002電子天平，瑞安市英衡電器有限公司；KQ-2200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JJ-2勻漿機(jī)，北京中科路建儀器設(shè)備有限公司；TGL-16LM臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；SD40制冰機(jī)，廣州市廣坤電器制造有限公司；PHS-25酸度計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠；725型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

試劑：磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-甲硫氨酸(Met)、核黃素、EDTA-Na2、氮藍(lán)四唑(NBT)、H2SO4、KMnO4、H2O2和愈創(chuàng)木酚，均為分析純。蘆薈膠，揚(yáng)州完美日用品有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 分別取同植株庫(kù)拉索蘆薈嫩葉(植株頂部葉)、中葉(植株中部葉)和老葉(植株底端葉)，清水沖洗3次，無(wú)菌水沖洗3次，用滅菌剪刀將葉片兩側(cè)刺剪掉，縱向剖開(kāi)，一半取凝膠(中間部分汁液)，一半取皮和凝膠。每個(gè)部位稱取5 g，3次平行。共獲得庫(kù)拉索蘆薈樣品6個(gè)。樣品1，老葉皮+凝膠；樣品2，老葉凝膠；樣品3，中葉皮+凝膠；樣品4：中葉凝膠；樣品5：嫩葉皮+凝膠；樣品6，嫩葉凝膠；樣品7，蘆薈膠(對(duì)照)，對(duì)不同部位庫(kù)拉索蘆薈樣品的抗氧化酶活用進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 庫(kù)拉索蘆薈不同部位的抗氧化酶活性測(cè)定

1) 酶液提取。取處理好的樣品各5 g，用勻漿機(jī)勻漿，置于加入0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.95)10 mL的預(yù)冷研缽中，冰浴研磨成漿，加入磷酸緩沖液40 mL，使終體積為50 mL。將提取液置于10 000 r/min冷凍離心機(jī)中，冷凍離心20 min，上清液保存于4℃冰箱，用于SOD、CAT、POD活性測(cè)定。

2) SOD活性測(cè)定。采用核黃素-NBT還原法進(jìn)行測(cè)定。依次量取L-甲硫氨酸(Met)溶液0.2 mL，EDTA-Na2溶液0.2 mL，磷酸緩沖液(pH 7.95)3.1 mL，氮藍(lán)四唑(NBT)溶液0.2 mL，核黃素溶液0.2 mL，混合搖勻。在3.9 mL反應(yīng)混合液試管中加入0.1 mL酶液，反應(yīng)總體積為4 mL。將試管置于太陽(yáng)光下光照30 min；同時(shí)配制2支對(duì)照管，各取3.9 mL反應(yīng)液和0.1 mL蒸餾水，其中一支光照測(cè)定作為最大光還原管，另一支放于暗處測(cè)定用于對(duì)照調(diào)零。用暗處試管對(duì)照調(diào)零后，避光測(cè)定A560(出現(xiàn)顏色)。

酶活性計(jì)算：SOD活性單位以抑制NBT光還原50%所需酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

SOD=[(Ack-AE)×V/ (1/2Ack×W×V1)

式中，Ack為照光對(duì)照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液總體積(mL)，V1為測(cè)定時(shí)樣品液用量(mL)，W為樣品鮮重(g)。

3)CAT活性測(cè)定。采用高錳酸鉀滴定法進(jìn)行。取4個(gè)50mL三角瓶(2個(gè)測(cè)定，2個(gè)對(duì)照)，測(cè)定瓶中加酶液2.5mL，對(duì)照瓶中加入高溫滅活的酶液2.5mL，分別加入2.5mL0.1mol/LH2O2，于30 ℃恒溫水浴鍋中保溫10min，立即加入2.5mL10%H2SO4。用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色并在30s內(nèi)不褪色為滴定終點(diǎn)。

酶活性計(jì)算：CAT活性單位用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示。

CAT活性=[(A-B)×Vt×1.7]/(W×V1×t)

式中，A為對(duì)照瓶高錳酸鉀滴定毫升數(shù)，B為酶液反應(yīng)后高錳酸鉀滴定毫升數(shù)，Vt為酶液總量(mL)，V1為反應(yīng)所用酶液量(mL)；W為樣品鮮重(g)；1.7為1 mL 0.1 mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7 mg H2O2。

4) POD活性測(cè)定。采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定。依次加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)2.9 mL、0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液1.0 mL、0.1 mL酶液。以加熱煮沸的酶液為對(duì)照，立即于40℃水浴中保溫5 min，待冷卻后加入0.1 mol/L H2O21.0 mL，以磷酸緩沖液為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定A470值。

酶活性：POD活性單位以每分鐘A470值變化(升高)0.01為一個(gè)酶活性單位(U)。

POD活性=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)

式中，ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，W為樣品鮮重，t為反應(yīng)時(shí)間(min)，Vt為酶液總體積(mL)，Vs為測(cè)定時(shí)酶液體積(mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位庫(kù)拉索蘆薈的SOD活性

由圖1可知，庫(kù)拉索蘆薈老葉凝膠的SOD活性顯著高于其他部位的凝膠和皮+凝膠，且與對(duì)照差異不顯著。不同部位SOD活性由高到低依次為老葉凝膠(59.84 U)>對(duì)照(57.21 U)>老葉皮+凝膠(46.63 U)>嫩葉皮+凝膠(44.45 U)>嫩葉凝膠(41.32 U)>中葉皮+凝膠(25.97 U)>中葉凝膠(25.62 U)。老葉凝膠中SOD 活性高于其皮+凝膠，而中葉和嫩葉凝膠中SOD 活性均低于其相應(yīng)的皮+凝膠。

注：1-老葉皮+凝膠；2-老葉凝膠；3-中葉皮+凝膠；4-中葉凝膠；5-嫩葉皮+凝膠；6-嫩葉凝膠；7-蘆薈膠(對(duì)照)，下同。
Note: 1，old leaf peel and gel; 2，old leaf gel; 3，middle leaf peel and gel; 4，middle leaf gel; 5，young leaf peel and gel; 6，young leaf gel; 7，Aloe veragel. The same below.
圖1不同部位庫(kù)拉索蘆薈的SOD活性
Fig.1 SOD activity of different parts inA.barbadensis

2.2 不同部位庫(kù)拉索蘆薈的CAT活性

由圖2可知，庫(kù)拉索蘆薈中葉皮+凝膠的CAT活性與嫩葉皮+凝膠的CAT活性差異不顯著，但二者顯著高于其他部位(老葉皮+凝膠除外)。不同部位庫(kù)拉索蘆薈CAT活性由高到低依次為中葉皮+凝膠(2.615 U)>嫩葉皮+凝膠(2.568 U)>老葉皮+凝膠(2.331 U)>對(duì)照(2.031 U)>老葉凝膠(0.877 8 U)>嫩葉凝膠(0.484 4 U)>中葉凝膠(0.469 2 U)。老葉、中葉和嫩葉的皮+凝膠中CAT活性均顯著高于其相應(yīng)葉片凝膠的活性，皮+凝膠的CAT活性是凝膠的3～6倍，說(shuō)明不同抗氧化酶在其不同部位具有選擇性。

2.3 不同部位庫(kù)拉索蘆薈的POD活性

由圖3可知，庫(kù)拉索蘆薈老葉皮+凝膠的POD活性顯著高于其余部位。不同部位庫(kù)拉索蘆薈POD活性由高到低依次為老葉皮+凝膠(44.16 U)>嫩葉皮+凝膠(38.35 U)>對(duì)照(27.47 U)>中葉皮+凝膠(24.11 U)>中葉凝膠(8.051 U)>嫩葉凝膠(6.529 U)>老葉凝膠(6.454 U)。表明，老葉皮+凝膠的POD活性最高，是凝膠的3～7倍。老葉、中葉和嫩葉的皮+凝膠中POD活性均顯著高于其相應(yīng)葉片凝膠活性(中葉除外)，皮+凝膠的POD活性是凝膠的3～6倍。

3 結(jié)論與討論

庫(kù)拉索蘆薈老葉、中葉、嫩葉中不同部位中SOD、CAT、POD的活性不同。庫(kù)拉索蘆薈老葉凝膠SOD活性最高，為59.84 U，中葉凝膠SOD活性最低，為25.62 U。中葉皮+凝膠CAT活性最高，為2.615 U，中葉凝膠CAT活性最低，為0.469 2 U。老葉皮+凝膠POD活性最高，為44.16 U，老葉凝膠POD活性最低，為6.454 U。開(kāi)發(fā)SOD和POD應(yīng)以庫(kù)拉索蘆薈老葉凝膠和老葉皮+凝膠為原料；開(kāi)發(fā)CAT應(yīng)以庫(kù)拉索蘆薈中葉皮+凝膠為原料。

從蘆薈葉齡看，老葉中SOD和POD活性顯著高于嫩葉，說(shuō)明抗氧化酶代謝合成在老葉中更加活躍。老葉中各類化合物種類和數(shù)量高于嫩葉，推測(cè)抗氧化酶活性與化合物合成也許存在一定相關(guān)性。從蘆薈部位角度分析，同植株同葉齡皮+凝膠部位的CAT、POD活性高于凝膠部位，說(shuō)明這些抗氧化酶在庫(kù)拉索蘆薈的皮部積累可能較多。

目前，蘆薈中抗氧化活性成分的研究主要集中在蘆薈多糖[7-8]、蘆薈酚類化合物和蒽醌類化合物[10]，蘆薈中的抗氧化酶是蘆薈具有抗氧化的功效成分之一，特別是關(guān)于庫(kù)拉索蘆薈老葉、中葉、嫩葉內(nèi)抗氧化酶活性對(duì)比研究較少。通過(guò)比較不同部位庫(kù)拉索蘆薈抗氧化酶活性，為其在保健品、化妝品方面的開(kāi)發(fā)與利用提供參考，今后還應(yīng)結(jié)合其他化學(xué)成分對(duì)不同部位庫(kù)拉索蘆薈進(jìn)行研究，進(jìn)行多指標(biāo)、多角度的中藥資源質(zhì)量評(píng)價(jià)將更具有現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值。