北京株水痘疫苗凍干保護劑的研究

姜雪鷗 安娜 馬娜 劉妍妍 曲鴿 李晴

近年來，在疫苗產業中，凍干保護劑里仍然存在著明膠的使用。明膠為大分子蛋白質，源于動物組織，也是細菌內毒素的主要來源[1]，會直接引起接種人員產生不良反應，WHO已經建議避免明膠在水痘疫苗中的使用。本研究采用我國自行分離的水痘-帶狀皰疹病毒疫苗株北京株（VZV84-7），用其生產的水痘疫苗具有較好的安全性和免疫原性[2-3]，北京株水痘活疫苗接種后其保護率達96.4%。通過優化保護劑，提高水痘疫苗在疫苗生產中的穩定性[4-5]。由于水痘帶狀皰疹病毒北京株（VZV84-7）比較脆弱，不能在污染物中或者結痂皮中長期存活，它對環境十分的敏感，在高于60℃的環境中會迅速被滅活，且該病毒的感染性僅在6.2≤pH≤7.8的范圍，由此可見，其范圍很窄[6]。所以為了提高北京株（VZV84-7）水痘疫苗的長期貯存能力，其保護劑需用凍干保護劑。

1 材料

（1）蔗糖：北化20120331；

（2）乳糖：SRS EXP：20131127；

（3）右旋糖酐：SIGMA lot#BCBF2323V Mr15000-25000 131220；

（4）L-精氨酸：上海康達；

（5）明膠：國藥滬試；

（6）尿素：北化20120117；

（7）人血白蛋白：成都蓉生；

（8）鹽酸：北化；

（9）甘露醇：SRS EXP：20130913；

（10）199培養基：上海康達20121201；

（11）谷氨酸鈉：上海協和20120505；

（12）L-谷氨酰胺：20121201。

2 操作過程

本次北京株（VZV84-7）凍干保護劑的對比試驗共分為2組，第一組為對照組，即含有明膠（常規生產用的凍干保護劑）的北京株水痘疫苗，共制備一批次；第二組為試驗組，即不含明膠的北京株水痘疫苗，共制備9批次。10個批次的北京株水痘疫苗的生產工藝和所用的液體均相同，屬于同一批次配備，試驗組的9批按照正交試驗法制備，見表1。

首先生產組從細胞組接過合格的細胞，2BS細胞的工作代27代連續傳代至37代，用40層細胞工廠傳代，細胞需長成致密單層，北京株水痘-帶狀皰疹病毒VZV84-7株，按照0.001～0.05 MOI加入到病毒培養液中，按照200 mL/層的病毒培養液通過滅菌后的分裝管道分裝至40層的細胞工廠中，于35℃培養，培養2～3天后，當細胞病變達到7%～10%，棄去舊的病毒培養液，用PBS液洗滌細胞工廠的細胞表面2次，洗后加入病毒維持液，于35℃培養24小時，當細胞病變達到70%以上時，棄去舊的病毒維持液，用PBS溶液清洗細胞工廠的細胞表面1次，然后加入EDTA溶液進行消化，待細胞表面出現毛玻璃狀態時，用PBS溶液收集病變的細胞，把收集的病變細胞于2～8℃，1 500 r/min的條件下，離心15 min，棄上清液[7]，用10種疫苗凍干保護劑（A-I及含明膠配方），分別收集細胞沉淀復溶，于-60℃以下保存，待檢定合格后取出凍融，經過超聲破碎，過濾，合并為半成品，然后對半成品進行滴定，送至分包裝室進行無菌灌裝，用合適的水痘疫苗凍干曲線進行凍干，制備北京株VZV84-7水痘減毒活疫苗[7-8]，凍干后，從每批次的水痘疫苗的成品中隨機抽取3支混合后進行成品的滴定、熱穩定、下降值（37℃放置一周后）的滴度、水分、外觀等的檢查。

表1 試驗組正交試驗的制備方法

表2 10個批次的水痘疫苗檢定結果

3 結果

以下為使用上述方法連續制備的10個批次的水痘疫苗的檢定結果，見表2。

其他檢定指標（pH值、滲透壓、溶解時間）均符合要求。

4 討論

由本次的試驗結果可以看出，選用A、B、C、D、E、含明膠凍干保護劑的北京株水痘疫苗的凍干前滴度均大于4.0，而凍干后的滴度只有D和含明膠的凍干保護劑的滴度是大于4.0，且它們的水分以及外觀等檢查項目都符合標準。

對于大多數的減毒活類疫苗的產品，凍干是提高疫苗穩定性的重要手段，為了提高凍干疫苗的穩定性，生物制品中加入保護劑是常用的方法，使用保護劑能夠更好地改變水痘疫苗在凍干過程中受環境等因素所造成的的損傷，可以更好地保持住生物樣品原有的生物活性以及結構，同時也能夠提升生物制品儲藏期內蛋白的穩定性。

根據本次實驗結果分析出，在水痘疫苗的制備當中，明膠充當賦形劑的作用，但它的過敏性及不良反應，導致其在以后的疫苗保護劑中終將會被替代，而此次試驗中的右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、乳糖的新型配方表現出可取代明膠的地位，并且由于明膠在對并北京株（VZV84-7）病毒的保護作用很小，所以可忽略其對疫苗病毒的保護作用[9-11]。如果新型的凍干保護劑應用在北京株水痘疫苗的生產工藝中，將會使水痘疫苗的安全性方面得到大幅度的提高，因此，取消明膠在水痘疫苗中的應用，對日益發展的生物制品行業是價值的。

5 小結

使用無明膠保護劑是減毒活疫苗類產品的研究趨勢，企業應該以盡可能加大保護效果為前提，對疫苗生產中明膠的含量、對疫苗滴度、穩定性等方面影響進行全面的研究，優先選擇公認安全的原輔料，以取消明膠在疫苗中的添加[1，12]。