雷公藤甲素對雨蛙素誘導的慢性胰腺炎小鼠模型胰腺纖維化的影響

譚 鵬， 陳 浩， 王安康， 錢保林， 黃治偉， 石 昊， 高 琳， 付文廣,

西南醫科大學附屬醫院 a. 四川省院士(專家)工作站; b. 肝膽外科; c. 健康管理中心, 四川 瀘州 646000

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一種進展性炎癥性疾病，在我國發病率約為13/105，且呈上升趨勢，其中約2.9%的新診斷患者在1年內被確診為胰腺癌[1]。CP的基本病理特征表現為不可逆的胰腺實質慢性炎癥損害、間質纖維化及腺泡細胞萎縮消失，病程遷延且預后不良，嚴重影響患者生活質量[2]。雷公藤甲素作為環氧二萜內酯化合物，又稱雷公藤內酯醇，是中藥雷公藤中的主要活性成分之一[3]。近年來的研究[4-6]表明，其具有諸多藥理活性，如抗癌、抗氧化、抗類風濕、抗老年性癡呆癥等。然而，目前尚無報道雷公藤甲素具有抗CP的藥理活性。本研究以雨蛙素誘導的CP小鼠模型為研究對象，基于NF-κB/IL-6信號通路，探索雷公藤甲素緩解CP發生的機制，闡明其新的藥理活性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級C57BL/6雄性小鼠15只，體質量(20±2)g，6～8周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(川)2015-030。實驗動物飼養于西南醫科大學SPF級實驗動物房，許可證號：SYXK(川)2018-065。本研究方案經西南醫科大學實驗動物倫理委員會審批(批號：201906-4)，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 主要試劑 雨蛙素、雷公藤甲素購自MCE (美國)，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自R&D Systems(美國)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自Beyoeime(中國)，天狼猩紅、馬松染色試劑盒購自Solarbio(中國)，NF-κB/p65兔多克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體購自Proteintech(中國)，IL-6兔多克隆抗體購自Servivebio(中國)，α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)兔多克隆抗體購自abcam(英國)，二抗購自Proteintech(中國)。

1.3 CP小鼠模型的構建及分組 15只6～8周齡C57BL/6小鼠適應性飼養2周后，隨機分為3組：對照組、雨蛙素組和雷公藤甲素組，每組各5只。雨蛙素組和雷公藤甲素組10只小鼠均給予腹腔雨蛙素注射50 μg/kg，每周注射3 d，6 次/d，每次間隔1 h，連續注射6周，構建CP模型，其中雷公藤甲素組5只小鼠在第3周開始同時腹腔注射100 μg/kg的雷公藤甲素，每周注射6 d，1 次/d，連續注射4周。對照組接受同雨蛙素組等劑量、同頻率的0.9%生理鹽水。所有小鼠均為第6周處理結束后處死。

1.4 樣本采集及檢測方法

通過外科手術摘除小鼠完整胰腺組織，稱重后取胰腺中部組織將其平均分成2份，1份置于4%多聚甲醛中用于組織學檢測；1份迅速置于液氮中，再轉入-80 ℃冰箱，待提取蛋白行蛋白質免疫印跡(Western Blot，WB)檢測。

1.4.1 胰腺組織病理學染色 胰腺組織HE染色觀察病理改變，并采用Kusske評分標準[7]對其進行定量評估；天狼猩紅染色及馬松染色觀察胰腺組織纖維化程度，通過Image J 1.43軟件計算胰腺組織天狼星紅染色紅色信號及馬松染色藍色信號的平均光密度值。

首先將胰腺組織在4%多聚甲醛中固定24 h，然后經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最后通過切片機制作4 μm石蠟切片。使用HE染色、天狼猩紅染色、馬松染色試劑盒并按照說明書步驟進行檢測。

1.4.2 ELISA檢測血清中IL-6表達 在造模最后1 d通過摘除眼球法收集3組小鼠血液，室溫靜止放置30 min，3000 r/min離心15 min，吸取上清，使用小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒并按照說明書步驟進行檢測。

1.4.3 免疫組化檢測α-SMA和NF-κB/p65 α-SMA為公認的纖維化程度的指標，NF-κB/p65為轉錄調控IL-6表達的關鍵轉錄因子，通過免疫組化染色觀察其在胰腺組織中的表達情況，并通過ImageJ 1.43軟件計算陽性信號的平均光密度值。

對4 μm胰腺組織石蠟切片進行常規二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，通過枸櫞酸鈉緩沖液高壓抗原修復法進行抗原修復，3%H2O2室溫孵育5～10 min以消除內源性過氧化物酶的活性，用10%山羊血清對切片進行封閉。使用NF-κB/p65抗體(1∶100)、α-SMA抗體(1∶100)于4 ℃孵育過夜，切片用PBS沖洗3次，二抗孵育1 h，使用DAB顯色液進行顯色，待顯色完全后用蒸餾水洗終止反應。依次通過蘇木精復染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍、脫水透明，最后用中性樹膠封片。

1.4.4 WB檢測NF-κB/p65、IL-6及α-SMA 通過WB檢測每組3只小鼠胰腺組織中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表達，并通過ImageJ 1.43軟件進行灰度值分析。使用RIPA強裂解液(Beyotime)并按照說明書步驟進行胰腺組織的蛋白提取，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime)對樣品進行濃度測定。制備聚丙烯酰胺凝膠，依次進行電泳、轉膜、封閉。加入一抗于4 ℃孵育過夜，然后加入相應的二抗室溫孵育2 h，通過使用凝膠成像分析儀進行化學發光顯影。

2 結果

2.1 胰腺組織重量比較 3組間胰腺組織重量比較差異有統計學意義(P<0.001)，雨蛙素組顯著低于對照組和雷公藤甲素組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 胰腺組織病理學染色結果 HE染色結果顯示，3組間胰腺組織病理評分比較差異有統計學意義(P<0.001)。 與對照組比較，雨蛙素組胰腺腺泡細胞結構破壞和炎癥細胞浸潤程度更為嚴重(P<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組腺泡細胞結構破壞和炎癥細胞浸潤顯著緩解(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 3組小鼠各項結果比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與雨蛙素組比較，2)P<0.05。

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖1各組小鼠胰腺組織的病理學改變(HE染色，×200)

天狼猩紅染色及馬松染色結果顯示，3組間天狼星紅染色紅色信號、馬松染色藍色信號的平均光密度值比較差異均有統計學意義(P值均<0.001)。與對照組比較，雨蛙素組胰腺組織膠原纖維表達顯著升高(P值均<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組胰腺組織膠原纖維表達明顯降低(P值均<0.05)(表1，圖2、3)。

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖23組小鼠胰腺組織的天狼猩紅染色(×200)

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖33組小鼠胰腺組織的馬松染色(×200)

2.3 血清IL-6水平的比較 ELISA檢測結果顯示，3組間IL-6水平比較差異有統計學意義(P<0.001)。雨蛙素組血清IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05)；與雨蛙素組相比，雷公藤甲素組血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)(表1)。

2.4 胰腺組織α-SMA和NF-κB/p65免疫組化結果 3組間α-SMA陽性信號平均光密度值比較差異有統計學意義(P<0.001)。雨蛙素組胰腺組織α-SMA蛋白的表達明顯高于對照組(P<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組α-SMA蛋白表達顯著降低(P<0.05)(表1，圖4)。

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖4各組小鼠胰腺組織α-SMA的免疫組化染色(×200)

3組間NF-κB/p65陽性信號的平均光密度值比較差異有統計學意義(P<0.001)。雨蛙素組胰腺組織中NF-κB/p65的表達明顯高于對照組，且明顯在細胞核內高表達(P<0.05)；與雨蛙素組相比，雷公藤甲素組NF-κB/p65蛋白的表達明顯降低(P<0.05)(表1，圖5)。

注：a，對照組；b，雨蛙素組；c，雷公藤甲素組。

圖53組小鼠胰腺組織NF-κB/p65的免疫組化染色(×200)

2.5 胰腺組織WB檢測結果 通過WB檢測每組3只小鼠胰腺組織中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達，結果顯示，3組間NF-κB/p65、IL-6、α-SMA的相對灰度值比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)。與對照組比較，雨蛙素組NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達水平明顯升高(P值均<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達水平明顯降低(P值均<0.05)(表2，圖6)。

圖63組小鼠胰腺組織NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表達

3 討論

CP是各種因素(酗酒、吸煙、損傷和遺傳因素等)導致的一種不可逆轉的慢性炎癥性疾病，主要表現為大量成纖維細胞增生和細胞外基質在胰腺內沉積導致腺泡細胞損失和胰腺進行性纖維化[8-9]。目前臨床上對于CP的治療主要以緩解癥狀及控制并發癥為主，缺乏對CP特效的治療藥物，故治療效果不滿意[10]。因此了解CP發生發展的分子機制，探索新的CP靶向治療藥物顯得尤為重要。雨蛙素作為膽囊收縮素的類似物，通過反復腹腔注射可誘導小鼠出現較典型的CP病理表現[11]，因此本研究以雨蛙素誘導的CP模型為基礎進行相關研究。

雷公藤甲素是雷公藤的主要生物活性成分，由于其獨特的二萜三環氧化合物結構和多種生物活性，引起了廣泛的研究和開發[12]。目前已有研究報道雷公藤甲素可以通過抑制NF-κB活性及CXCL11表達減輕重癥急性胰腺炎(severe cute pancreatitis，SAP)時胰腺組織病理損傷[13-14]。本研究發現，雷公藤甲素組小鼠的腺泡細胞結構破壞和炎癥細胞浸潤程度較雨蛙素組明顯緩解，且胰腺纖維化程度也顯著弱于雨蛙素組，提示，雷公藤甲素除可以治療SAP外，還可進一步用于CP的治療。

NF-κB是一種具有多向性調節作用的核轉錄因子，其發揮主要生理作用的是p50和p65亞基組成的異源二聚體，當機體受到創傷后被激活，并參與調節多種炎性基因轉錄過程，介導急慢性炎癥反應[15-17]。已有研究[18]表明，在雨蛙素誘導的小鼠CP模型中NF-κB/p65表達明顯上調，且受NF-κB/p65轉錄調控的IL-6的表達也明顯上調。在肺部炎癥、多發性骨髓瘤、SAP的研究[19]中發現，雷公藤甲素通過抑制NF-κB通路的激活從而下調炎癥因子的表達。本研究發現，與雨蛙素組相比，雷公藤甲素組胰腺組織NF-κB/p65的表達被明顯抑制，且下游IL-6在胰腺及血清中的表達量都明顯降低。以上結果表明雷公藤甲素可能通過抑制NF-κB/p65表達，進而下調炎癥因子IL-6的表達與分泌，減緩雨蛙素誘導的小鼠CP。

本研究從組織和蛋白水平進行研究發現，雷公藤甲素可以減緩雨蛙素誘導的小鼠CP纖維化進程，同時明顯抑制胰腺組織NF-κB/p65表達，為胰腺纖維化及CP的靶向治療提供重要的理論基礎，為CP的臨床治療及預防提供新的思路。

表2 3組小鼠胰腺組織NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的灰度值比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與雨蛙素組比較，2)P<0.05。