SD大鼠中縫背核腦立體定位的最佳參數研究＊

郭海波，全 睿，王 慧

中縫核位于大腦中縫附近的狹窄區域內，可分成數個核團，總稱為中縫核群。其特點是產生單胺類神經遞質 5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT），中縫背核（dorsal raphe nucleus，DRN）是中縫核群內5-HT含量最多的核團，而5-HT的合成、儲存和釋放與多種生理功能有關，如：睡眠、體溫、心血管、情緒和精神活動、下丘腦內分泌、痛覺和鎮痛等［3］。故利用向DRN微量注射藥物的方法來研究與中縫核或5-HT相關的神經機制的動物實驗越來越受到學者的青睞。而大鼠作為最常用的實驗動物，對其腦部DRN微量注射實驗的成功與否，參數的定位準確是關鍵。而利用腦立體定位圖譜快速定位核團是開展實驗的前提。對于不同品系的大鼠，圖譜的選擇有所不同。Paxinos＆Watson大鼠腦立體定位圖譜是科研當中使用最廣、影響最大的圖譜，它是以Wistar大鼠作為標本制定。而國內課題組最常用的實驗動物是Sprague-Dawley（SD）大鼠；SD大鼠最初來源于Wistar大鼠［4］，但仍不同于Wistar大鼠，Wistar大鼠頭部較寬、耳朵較長；而SD大鼠頭部狹長［5］；正是有如此差異，所以在腦立體定位圖譜的選擇上，特別是在腦部核團精準定位上有著不可忽視的差別。基于此，該課題組對10只SD大鼠的DRN進行了位置探索，參照兩本腦立體定位圖譜，根據定位后的切片染色結果，對DRN的立體定位參數進行了研究，實踐了定位技術的各個環節，提高了定位準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年清潔級SD雄性大鼠10 只，體重（250±20）g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，許可證號 NO.SCXK（渝）2007-0008。實驗條件符合貴州中醫藥大學動物健康、福利和處死等相關要求。

1.1.2 主要試劑 4%多聚甲醛溶液、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器和設備 手持式90型顱骨鉆（韓國SAESHIN公司），注藥導管（長10 mm，外徑0.64 mm，內徑0.45 mm）、CMA120腦立體定位儀 （深圳瑞沃德科技公司），冷凍切片機 （德國Leica CM1950冷凍切片機），BX53生物顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 方 法

1.2.1 顱腦固定 大鼠稱重后按3.5 mg/100 g給予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，頭頂部備皮，將大鼠門齒固定在齒板上，耳桿插入兩側外耳道，調節兩側耳桿至距離相等，略微調整齒板高度使顱腦被固定于水平位。碘酊和乙醇依次消毒，于顱骨頂部縱向切開皮膚，切口長約2.0 cm，剝離骨膜，暴露前囟、人字縫，對鉆孔位置進行標記。

1.2.2 核團定位 （1）幾個定位概念。根據圖譜確定核團相對于Bregma（前囟）的坐標值，AP（Anterior-Posterior）值：前囟前后，立體定位儀Y軸；ML（Medial-Lateral）值：中逢內外，立體定位儀 X軸；DV（Dorsal-Ventral）值：硬腦膜下，立體定位儀 Z軸。進針時一般還會用到R/L（Right-Left）值：中縫左右，和 H（High）值：進針深度。 （2）根據 Paxinos＆Watson大鼠腦立體定位圖譜，中縫核的位置冠狀面看從AP-6.84 mm開始顯示，持續到AP-8.04 mm，之后縮小，直至中縫背核尾側部逐漸消失。在AP-7.32 mm處中縫核上下徑在5.6～7.2 mm，此處為圖譜所示中縫背核直徑最寬的位置，認為是最佳進針位置，選擇 AP-7.6 mm、R/L 0.0 mm、H 6.5 mm 為進針位置。（3）根據包新民教授編著的大鼠腦立體定位圖譜，中縫核的位置冠狀面看從前囟-6.4 mm開始顯現，至-7.4 mm達到左右直徑最寬，此后中縫核開始逐漸縮小，到-9.0 mm在冠狀面消失。由圖譜切面看在前囟-7.4 mm處上下徑為 5.1～6.4 mm，為DRN的最佳進針位置，選擇AP-7.4 mm、R/L 0.0 mm、H 6.2 mm為進針位置。

1.2.3 埋置注藥導管 對大鼠顱骨頂部進行標記，使用顱骨鉆在顱骨上開窗直徑1 mm、深度0.5 mm的圓洞，用細針頭挑破硬腦膜，以避免硬腦膜對微量注射導管產生阻礙。在腦立體定位儀標尺上確定立體參數，以保證置入的準確性。將導管進入到所需位置后，外用牙科水泥固定，待水泥干硬后，解除腦立體定位儀固定桿。所有大鼠手術完畢后腹腔注射青霉素鈉40萬U，連續3 d，單籠喂養，1 W后灌注取腦。

1.2.4 取腦及組織固定 將大鼠麻醉后，仰臥，四肢固定于鼠板上，下墊冰袋，提起腹部皮膚，在劍突下打開腹腔，暴露肌層，沿兩側肋弓剪開胸腔，用止血鉗夾持劍突上翻，暴露胸腔；剪斷心臟周圍結締組織，游離心臟，充分暴露心臟及升主動脈［6］，從左心室底部插入灌流針，深入到主動脈根部，用動脈夾固定針體，剪開右心耳放血。快速灌流生理鹽水200 ml，待右心耳流出液呈透明狀，換用4%多聚甲醛100 ml繼續灌流，可見大鼠四肢伸展抽搐、尾巴僵硬、全身強直，灌流直至多聚甲醛完畢。將大鼠俯臥固定，剪開頭部皮膚，斷頭剝離顱骨，取出大腦。切忌動作粗暴，勿使金屬導管損傷腦組織［6］。取出腦組織迅速置于4%多聚甲醛的標本瓶中，4℃固定沉底后轉移到30%蔗糖溶液脫水。

1.2.5 冷凍切片及染色 腦組織脫水后取出，采用冰凍切片，進行快速蘇木素-伊紅染色［7］，中性樹膠封固后顯微鏡下觀察。

2 結果

經過比對，筆者認為兩本腦立體定位圖譜在SD大鼠DRN的定位上存在著差異。按照Paxinos＆Watson大鼠腦立體定位圖譜，選擇AP-7.6 mm、R/L 0.0 mm、H 6.5 mm定位參數，發現進針部位較深，達到了DRN腹側部，接近中縫核下端（圖1A）。以包新民編著的大鼠腦立體定位圖譜為依據，選擇AP-7.4 mm、R/L 0.0 mm、H 6.2 mm 為定位參數，發現進針部位在DRN，深度在DRN背部和腹側部之間，位置較為合適（圖1B）。

圖1 大鼠腦組織切片染色

3 討論

腦科學是生命科學中最為活躍和最有發展前景的科學。腦科學的研究離不開實驗動物，而大鼠由于大小合適、繁殖力強、經濟實惠是神經科學研究中最常用的實驗動物。明確大鼠中縫背核立體定位參數在中縫核或5-HT相關的微量注射研究中至關重要，決定著實驗結果的準確性。依據腦立體定位圖譜快速確定核團位置是實驗開展的前提。當前應用最廣的是Paxinos＆Watson大鼠腦立體定位圖譜，其是以Wistar大鼠為標本制作，在實驗中以其他品系大鼠作為實驗動物時，立體定位的參數的確定會有一定差異。SD大鼠作為神經科學中應用最為廣泛的實驗大鼠之一，明確其中縫背核立體定位參數，在科學研究中有著積極意義。搜索相關文獻可知［8-10］，國內課題組使用的多數為SD大鼠，利用Paxinos＆Watson腦立體定位圖譜，在確定DNS定位參數時，有的直接參考既往文獻，有的求取校正系數，如有學者［8］使用SD雄性大鼠，依據Paxinos＆Watson腦立體定位圖譜，先是測量出大鼠實際前后自間距M，求取校正系數K=M/9.0，根據K值再求取實際坐標 X'（矢狀縫旁）=X×K，Y'（前囟后）=Y×K，Z'（水平面下）=Z×K，以此來獲得中縫核的立體定位參數。

綜上所述，對大鼠腦組織的神經核團進行準確的立體定位是開展相關研究的前提，大鼠大腦因品系的不同以及月齡的大小而有所差別，目前尚未看到有研究不同品系以及不同月齡大鼠大腦部核團定位的相關文獻，故探討和實踐不同品系大鼠的腦部核團的定位參數具有積極意義。要達到對大鼠腦部核團的準確定位，必須熟悉大鼠腦部的組織結構，嫻熟的掌握和準確的運用腦立體定位儀，恰當地選擇合適的腦立體定位圖譜，才能獲得準確的核團立體定位參數。