山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞的增殖及成骨分化的影響

黃佳純 林燕平 陳桐瑩 柴爽 黃宏興

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006 2. 廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心，廣東 廣州 510240 3. 廣州中醫藥大學附屬第三醫院，廣東 廣州 510240

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)主要是由骨質量和骨密度下降引起的，是一種全身性代謝性骨病變，骨微結構失衡導致的骨脆性增加，很容易導致骨折的發生。其中，成骨細胞是促進骨形成的主要功能細胞，是骨質疏松發生中起關鍵作用的細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。成骨細胞的增殖和成骨分化在骨量丟失中起著抑制作用[1]，因此，探究如何促進成骨細胞增殖分化對預防和治療骨質疏松癥具有重要意義。山茱萸具有補益肝腎的功效，臨床上可作為治療骨質疏松中藥配方的組成藥物之一，是傳統醫學應用廣泛的藥物[2]。山茱萸新苷Ⅰ是從山茱萸提取出來的一種環烯醚萜苷，屬于山茱萸的有效成分。多研究[3-4]表明，內質網應激對于成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞的生長起著重要作用。基于此，本研究主要研究山茱萸的有效成分山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞的增殖分化及相關內質網應激通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器：超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；細胞培養箱、離心機(美國Thermo Fisher公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應擴增儀(CFX96TM)；Mini-protean tetra小型垂直電泳儀/轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡(美國OLYMPUS公司)。

1.1.2動物與藥物：出生24 h SD大鼠購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，SPF級，質量不限，性別不限。山茱萸新苷Ⅰ(山茱萸新甙Ⅰ，cornuside Ⅰ)購自成都曼思特生物科技有限公司，提取來源為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸的干燥果實，分子式為C30H50O20，分子量542.49，為類白色晶體，可溶于DMSO、甲醇，純度≥98%，20 mg/支。

1.1.3材料與試劑：alpha-MEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)，胰酶(美國sigma公司)，Western blot試劑盒、ALP染色試劑盒(上海碧云天)，PCR試劑盒(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1大鼠原代成骨細胞的提取與培養：成骨細胞的提取：乳鼠2只，脫臼處死后在75%酒精中10 min充分浸泡消毒備用，超凈臺內取出頭蓋骨，預冷的PBS緩沖液沖洗3次以去除脂肪組織及殘留血，將顱骨剪成1 mm×1 mm的骨碎片，移入15 mL離心管內，加入1 mL 0.25%胰酶，37 ℃預消化20 min后加入完全培養基3 mL終止消化，1 000 r/min離心5 min后棄上清，再加入0.1%的Ⅱ型膠原酶1 mL，37 ℃中消化1 h后1 000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌2次，每次都1 000 r/min離心5 min，棄上清液，最后一次棄上清后加入完全培養基，吹打均勻后200目濾網除去骨碎片，濾液于培養皿中培養，37 ℃，5%CO2孵箱中孵育5 min，更換培養皿，重復2次。每隔48 h換液1次。

1.2.2成骨細胞的鑒定：活細胞形態觀察：每天鏡下觀察細胞形態變化及生長狀況并進行拍照。堿性磷酸酶活性檢測細胞化學染色：將純化后的第2代細胞調整細胞濃度至5×107/L，接種到12孔細胞培養板中，每孔接種0.75 mL，以后每3天換液。待細胞分布均勻、約80%融合時，PBS洗3次，體積分數95%乙醇固定30 min，按堿性磷酸酶染色試劑盒要求進行。主要觀察成骨細胞的形態、特征性染色。

1.2.3CKK8：收集P4細胞，制成100個/μL的細胞混懸液，加到96孔板。37 ℃，5%CO2孵育過夜。隔日換液，加入相應濃度梯度(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mmol/mL)含山茱萸新苷Ⅰ的培養基和完全培養基(空白對照組)，每組設5個復孔，37 ℃，5%CO2中培養。干預的第1、3、5、7 天進行檢測：每孔加入10 μLCKK-8溶液，37 ℃孵育30 min，測定450 nm各孔的吸光值。

1.2.4ALP染色：收集P4細胞，制成100個/μL的細胞混懸液，加入24孔板中，37 ℃，5%CO2培養過夜，隔日按分組加相應濃度梯度(0.063、0.125、0.25、0.5、1 mmol/mL)含山茱萸新苷Ⅰ-成骨誘導液或成骨誘導液(空白對照組)。3 d換液1次，37 ℃，5%CO2培養7 d后，PBS洗滌3次，4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS洗滌3次，按照試劑盒的說明配置成BCIP/NBT染色工作液；最后一次洗滌完畢后去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保樣品被充分覆蓋；室溫避光孵育30 min，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌2次終止顯色反應；去除殘留液體，完成顯色，拍照。

1.2.5RT-PCR檢測基因表達：收集P4細胞，制成100/μL的細胞混懸液，加到6孔板中，置37 ℃，5%CO2培養過夜，隔日換液，參照CKK-8及ALP染色的實驗結果加入適宜濃度的藥物，設立空白組，細胞培養箱培養48 h后提取各組細胞的總RNA，測定RNA溶液的純度后進行逆轉錄。檢測Wnt2、β-catenin、BMP2、OPG、NOX4、PERK的mRNA表達情況。以GAPDH作為內參照，每組均做3個重復，取均數，采用雙標準曲線相對定量方法對基因進行定量分析。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達：收集P4細胞，制成100個/μL的細胞混懸液，加到6孔板中，置37 ℃，5%CO2培養過夜，隔日換液，參照CKK-8及ALP染色的實驗結果加入適宜濃度的藥物，設立空白組，細胞培養箱培養48 h后分別提取各組細胞總蛋白，12 000 r/min離心15 min，取上清100 μL，測出蛋白濃度，配制樣品，通過上樣、電泳、轉膜、封閉、孵育一抗二抗后顯影，檢測Wnt2、β-catenin、BIP、CHOP、PDI蛋白的表達情況，測出相應灰度值進行分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠原代細胞的鑒定

倒置相差顯微鏡下的大鼠成骨細胞充分鋪展，多呈現梭形。細胞伸展，有長短不一的突起，呈集落樣生長趨勢，見圖1。堿性磷酸酶活性檢測結果可見大量染色陽性細胞出現，細胞膜及胞漿內顆粒染色呈藍黑色顆粒，塊狀深染顆粒，見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡下的大鼠成骨細胞Fig.1 The rat osteoblasts under the inverted phase contrast microscope

圖2 堿性磷酸酶活性檢測細胞化學染色Fig.2 Alkaline phosphatase activity assay for cytochemical staining

2.2 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞的增殖影響

不同濃度山茱萸新苷Ⅰ干預下，成骨細胞出現不同程度的增殖，多在第1～5天時表現1個逐漸上升的趨勢，而在第5天之后增殖速率隨即下降；其中當藥物濃度為1 mmol/mL、干預時間為5 d時，OD值最高(圖3)。ALP染色顯示出藥物干預后的成骨細胞的顏色明顯深于未加藥的一組，即加藥組細胞成骨分化程度優于空白對照組(圖4)。

圖3 CKK8檢測不同濃度山茱萸新苷Ⅰ干預下細胞的增殖Fig.3 CKK8 test for the proliferation of osteoblasts intervened by different concentration of cornuside I

圖4 ALP染色檢測不同濃度山茱萸新苷Ⅰ干預下細胞的成骨分化Fig.4 ALP staining for detection of osteogenic differentiation of osteoblasts intervened by different concentration of cornuside I

2.3 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞基因表達的影響

與空白對照組相比，山茱萸新苷Ⅰ組的成骨細胞Wnt、BMP2、OPG和NOX4的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)，β-catenin升高幅度不大，但差異具有統計學意義(P<0.01)，而PERK的mRNA表達水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖5)。

圖5 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞基因表達的影響Fig.5 The effect of cornuside I on mRNA expression of osteoblasts

2.4 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞蛋白表達的影響

與空白對照組相比，山茱萸新苷Ⅰ組的成骨細胞Wnt、β-catenin、PDI蛋白表達量顯著升高(P<0.01)，CHOP表達亦有輕微上升，但不明顯(P>0.05)。而BIP的蛋白表達水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖6，表1)。

表1 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細胞蛋白相對表達量的影響Table 1 The effect of cornuside I on protein expressions in osteoblasts

注：與對照組相比，①P<0.01，②P<0.05，③P>0.05。

圖6 成骨細胞中(Wnt、β-cantenin、BIP、CHOP、PDI)蛋白表達Fig.6 The protein expressions of Wnt, β-cantenin, BIP, CHOP, and PDI in osteoblasts

3 討論

OP是一種全身代謝性骨病，主要以骨量減少和骨微結構退化為特征，它引起最嚴重的并發癥是骨脆性增加帶來不斷上升的骨折風險[5]。相關調查表明，目前骨質疏松癥已經是世界五大疾病之一[6]，據統計，如今全世界患骨質疏松癥的已遠遠超過2億人數，估計在2020年，我國骨質疏松癥患者將占全世界骨患者人數的一半以上，增加到3億人，還有研究表明，在2050年估計用于骨質疏松性骨折的醫療費用將達到1 630億元[7]，故對骨質疏松癥的防治是刻不容緩的。

山茱萸是補益肝腎的傳統中藥，研究表明[8]，山茱萸總甙能對調節去勢大鼠骨組織的TRPV6、TRPV5蛋白表達起作用，其通過改變TRPV6/TRPV5的比值來影響成骨細胞和破骨細胞功能，有促成骨和提高骨密度的功效。山茱萸苷能提高大鼠皮層神經細胞存活率、線粒體的抗氧化酶活性、呼吸酶活性和呼吸控制率及ATP含量，減少線粒體丙二醛的產生，這跟細胞內Ca2+水平的升高和Caspase-3活性受到抑制相關[9]。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)與骨發育關系緊密，Hamamura等[10]的實驗證明，持續的ERS會促使成骨細胞發生調亡，反之，短促而弱的ERS可顯著提升骨分化因子如Runx2等的表達。動物實驗[11]證明，苯基丁酸對成骨細胞分化、礦化能力和骨形成起到一定的作用，這是通過減弱成骨細胞中的內質網應激起作用的。阿侖膦酸鈉是臨床上治療骨質疏松癥的一線用藥，研究發現[12]其能通過介導內質網應激來促進前破骨細胞的凋亡。內質網應激是線粒體應激發生的始動環節，線粒體在人衰老、癌癥的細胞凋亡、信號轉導中起著重要的作用，在細胞中充當著生命活動控制中心的角色，近年來的研究表明線粒體與骨質疏松癥的發生關系密切[13]。重鏈結合蛋白(heavy-chain binding protein，BIP/GRP78)是一種分子伴侶，它能引導新生蛋白進入內質網幫助蛋白質正確裝配。蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)一方面可以促進蛋白內或蛋白間形成正確的二硫鍵，另一方面也可以催化某些蛋白的二硫鍵的形成。Hino等[14]發現骨質疏松患者體內功能不活躍的成骨細胞，其PDI的表達顯著低于健康人體內功能活躍的成骨細胞。C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)是轉錄因子C/EBP的同源蛋白，研究發現，內質網應激發生時，CHOP的表達水平上調，并且CHOP可介導程序性的細胞死亡即細胞凋亡。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)是一種人體內由NOX4基因編碼的酶，屬NADPH氧化酶NOX家族，研究表明NOX4受PDI所調節[15]，PERK是位于內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，與GRP78/BiP解離后可以促進真核細胞蛋白質翻譯起始復合體2α磷酸化，該復合體位于內質網外側，有抑制大多數 mRNA 的翻譯并降低蛋白質合成速率的作用，這樣可以大大減輕內質網負荷，對內質網穩態的恢復有著極大裨益。

在本研究中，山茱萸新苷Ⅰ干預下，成骨細胞的增殖得到明顯的促進，成骨細胞的Wnt2、β-catenin mRNA及蛋白的表達、成骨相關基因OPG、BMP2相比對照組都呈現出上升趨勢，說明山茱萸新苷Ⅰ在Wnt/β-catenin信號通路上起促進作用。GRP78/BIP和PDI的蛋白表達量相對于空白對照組是明顯上升的，而CHOP的蛋白表達量并沒有發生太大的差異，有趣的是，PERK的基因表達是下降的，與前人所得出的結果有所矛盾，說明在內質網應激的層面上還有很多需要深入探究的地方。

綜上所述，山茱萸新苷Ⅰ確實促進成骨細胞的增殖及成骨分化，該中藥單體可正向調節成骨細胞內的Wnt/β-catenin信號通路，促進分子伴侶的表達，提高內質網正確折疊蛋白的速率，具有雙向調節ERS的潛能。本研究通過從內質網應激的角度上探討山茱萸有效成分之一山茱萸新苷Ⅰ促進成骨細胞的增殖分化的作用機理，在一定程度上豐富了補腎中藥山茱萸在防治骨質疏松癥上的理論知識。