水通道蛋白過表達對脊髓損傷大鼠便秘的影響

徐珮珮，楊明亮，劉長彬，李雅靜，劉梓桐，李建軍

1.首都醫科大學康復醫學院，北京市 100068；2.中國康復研究中心北京博愛醫院脊柱脊髓神經功能重建科，北京市 100068；3.北京腦重大疾病研究院神經損傷與修復研究所，北京市 100068；4.北京市神經損傷與康復重點實驗室，北京市 100068；5.首都醫科大學附屬北京天壇醫院康復醫學科，北京市 100070

腸道功能障礙是脊髓損傷后較為常見的并發癥，會引起腹脹、腹痛和頑固性便秘等癥狀。據統計，近半數脊髓損傷患者存在嚴重便秘問題[1]。通常認為，脊髓損傷后腸道功能障礙與大便干硬導致糞便在結腸內停留時間過長、水分過度吸收等有關。

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是控制各種細胞含水量的膜水通道之一，與先天性白內障、腎源性尿崩癥等多種疾病有關[2]。在胃腸道中，AQPs的異常表達可見于多種疾病。近年來發現，腸道黏膜AQPs 過度表達與便秘存在一定關系。結腸中，參與水轉運的AQP 包 括AQP1、AQP2、AQP3、AQP4 和AQP8[3‐4]。其中AQP1、AQP3 和AQP4與便秘關系更密切[5‐6]。Ikarashi等[7‐8]的實驗也證明AQP3功能或表達的降低會導致腹瀉，推測可能是降低了結腸管腔側到血管側的吸水性。結腸中的AQPs 可能在一定程度上參與調節糞便含水率。

本研究觀察大鼠脊髓損傷后結腸AQP1、AQP3和AQP4 的表達變化，檢測其表達水平與糞便含水率的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48 只SPF 級Sprague‐Dawley 大鼠，體質量(220±10) g，由北京維通利華公司提供，許可證號SCXK(京)2009‐0017，分為對照組(n=24)和脊髓損傷組(n=24)。大鼠單籠飼養，室溫(21±1)℃，濕度30%～70%，12 h黑夜‐白晝循環，自由取食及飲水。實驗前，所有大鼠均在標準環境下飼養7 d。研究設計和實驗操作均符合首都醫科大學動物倫理委員會的要求，倫理審查號AEEI‐2019‐045。

1.2 主要試劑及儀器

DH‐101‐2電熱恒溫鼓風干燥箱：天津中環實驗電爐有限公司。AQP1 抗體、AQP3 抗體、AQP4 抗體：武漢賽維爾生物科技有限公司。HistoFAXS 軟件：奧地利TISSUE GNOSTICS 公司。1.48 版Image J 軟件：美國國立衛生研究院。

1.3 動物模型

術前禁食不禁水12 h。予動物5%異氟烷誘導麻醉，2%異氟烷維持麻醉。大鼠俯臥位，背部正中切口，顯露T7‐9椎板并去除，顯露胸髓，于T8椎體位置用手術剪橫斷脊髓，建立T8脊髓損傷模型[9‐11]。脊髓殘端出血，用明膠海綿覆蓋止血，出血通常15～30 s停止。縫合肌肉和皮膚。對照組僅咬開椎板，暴露脊髓后關閉傷口。術中大鼠采用體位暖墊保暖。術后肌注青霉素20萬U，每天1次，連續7 d。每天兩次給予手動輔助脊髓損傷大鼠排尿，同時按摩和被動活動雙下肢防止壓瘡。

1.4 評定方法

1.4.1 Basso‐Beattie‐Bresnahan(BBB)評分

于造模前，造模后第1、3、7、14、28 天，每組取8 只大鼠，采用BBB 評分評定大鼠雙側后肢運動功能。將大鼠置于直徑約90 cm、高7～10 cm 的塑料池內，底面粗糙，由兩位獨立檢查人員觀察大鼠連續4 min 內的運動能力。0 分，完全下肢癱瘓；21 分運動能力正常[12]。

1.4.2 糞便含水率

術前，術后第3、14、28 天，每組取8 只大鼠，評估兩組糞便含水率。評估前3 d 每只大鼠定量給食30 g/d、給水50 ml/d，評估在早晨8 點開始。先將大鼠轉移至無墊層的單獨觀察籠中，禁食禁水2 min。2 h 后檢查者用鑷子從大鼠肛門處收集新鮮糞便顆粒，用塑料袋密封，稱濕重；90 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥48 h后，稱得干重。依據公式計算糞便含水率。

1.4.3 免疫組化技術檢測AQP1、AQP3 和AQP4 在結腸組織中的表達

兩組在術后第3、14、28 天各處死大鼠8 只，在距肛門3 cm 處切取1 cm 左右結腸標本。4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，片厚4～5 μm，脫蠟至水，切片高壓蒸鍋法抗原修復，PBS 沖洗。分別加AQP1 (GB11310,1∶ 2000)、AQP3(GB11395,1∶1000)、AQP4(GB11311‐1,1∶1000)一抗，4 ℃孵育過夜。0.2% PBS 液沖洗5 min 后，加HRP 標記的二抗，室溫孵育2 h，復染細胞核后脫水封片[15]。采用Histo‐FAXS 軟件對所有切片進行20 倍放大成像。采用Im‐age J 軟件測量每張切片陽性著色面積和積分光密度(integrated density,ID)[16]。

1.4.4 脊髓、腸道HE染色

術后第28 d，將大鼠麻醉(方法同前)，固定(方法同前)后取脊髓損傷區、結腸(距肛門3 cm 處) 組織標本各1 cm，石蠟包埋，切片5 μm 厚，常規HE 染色。采用Olympus光學顯微鏡觀察。

1.5 統計學分析

采用GraphPad Prism v 5.0、SPSS 22.0 生成統計分析。計量資料以(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。組內不同時間點比較采用單因方差分析和LSD 檢驗。采用Pearson 相關分析檢驗糞便水含率與AQPs的相關性。顯著性水平α=0.05。

2 結果

脊髓損傷組出現明顯的便秘、尿潴留等癥狀。對照組未出現神經功能障礙或便秘。

2.1 BBB評分

對照組術后各時間點間BBB 評分無顯著性差異(P>0.05)。脊髓損傷組術后BBB 評分時間效應顯著(P<0.001)，且均顯著低于對照組(P<0.001)。見表1。

2.2 糞便含水率

對照組各時間點糞便含水率無顯著性差異(P>0.05)。脊髓損傷組術后各時間點糞便含水率均顯著降低(P<0.001)，隨著時間延長略有增加，但均顯著低于對照組(P<0.001)。見表2。

2.3 AQP1、AQP 3、AQP 4在結腸組織中的表達

2.3.1 AQP1

AQP1 的表達主要分布在結腸黏膜上皮細胞中，在細胞頂端、基底側和腔面較為豐富。少量陽性表達于黏膜下層和肌層。與對照組相比，脊髓損傷組陽性細胞染色更明顯，呈棕褐色。見圖1。脊髓損傷組第3、14、28 天結腸黏膜細胞AQP1 表達均顯著高于對照組(P<0.001)。見表3。

2.3.2 AQP3

AQP3 主要表達在結腸黏膜頂部的上皮細胞中，集中在基底面和管腔面，少見于杯狀細胞，呈黃色或棕黃色。在著色量及程度上，脊髓損傷組高于對照組。見圖2。脊髓損傷組第3、14、28 天結腸黏膜AQP3表達均顯著高于對照組(P<0.001)。見表4。

2.3.3 AQP4

AQP4 陽性細胞多見于結腸黏膜頂端，以細胞膜基底側為主，杯狀細胞少見。脊髓損傷組AQP4 陽性細胞表達顯著高于對照組。見圖3。脊髓損傷組第3、14、28 天結腸黏膜AQP4 表達均明顯高于對照組(P<0.01)。見表5。

表1 各組不同時間點BBB評分比較

表2 各組不同時間點糞便含水率比較

圖1 各組不同時間點結腸AQP1表達(免疫組織化學染色，bar=50 μm)

表3 各組不同時間點結腸AQP1表達(×107,ID)

表4 各組不同時間點結腸AQP3表達(×107,ID)

2.4 AQPs表達與糞便含水率的相關性分析

AQP1、AQP3 和AQP4 均與糞便含水率呈顯著負相關(r=-0791～-0.730,P<0.001)。見圖4。

2.5 脊髓、結腸組織病理

脊髓損傷組脊髓內部結構紊亂，灰白質破壞，中央管破裂，神經細胞壞死。對照組脊髓結構完整，灰白質結構清晰。見圖5。脊髓損傷組結腸見炎性細胞浸潤，結腸隱窩萎縮，吸收細胞和杯狀細胞數目減少，黏液分泌減少。對照組結腸未見明顯炎癥反應。見圖6。

3 討論

結腸的一個重要功能是重吸收腸道內容物的水分。人類的結腸在滲透壓梯度下每天吸收水分約1.5～2 L。由于結腸上皮細胞間連接緊密形成屏障，水由結腸腔內進入結腸黏膜中，需要通過黏膜上皮細胞上AQPs 轉運。在AQP 家族中，AQP1、AQP3、AQP4、AQP7、AQP8都存在于結腸，與結腸水的吸收與分泌存在很大關系[17‐20]，它們的改變可能導致AQP 對水轉運的干擾。

圖2 各組不同時間點結腸AQP3表達(免疫組織化學染色，bar=50 μm)

圖3 各組不同時間點結腸AQP4表達(免疫組織化學染色，bar=50 μm)

AQPs 異常表達可見于多種腸道疾病。在慢傳輸型便秘大鼠模型[21]和糖尿病大鼠鏈脲霉素誘導的胃腸功能障礙[22]中都觀察到AQP1 表達增加。而在輪狀病毒腹瀉小鼠模型中，結腸AQP1、AQP4、AQP8 蛋白表達明顯降低[23]。AQP3 廣泛表達于遠端結腸黏膜上皮細胞[24]，其增加或減少會導致便秘或腹瀉[25‐27]。AQP4 則在結腸上皮細胞的基底外側膜中高度表達。AQP4 的下調與腹瀉存在一定關系[28]。在霍亂毒素引起的腹瀉[29]、過敏性腹瀉[30]和炎癥性腸病患者[31]中，都觀察到AQP4顯著下調。

表5 各組不同時間點結腸AQP4表達(×107,ID)

圖5 兩組脊髓損傷組織(HE染色，×20)

圖6 兩組結腸組織(HE染色，bar=100 μm)

本研究顯示，脊髓損傷大鼠結腸黏膜上皮細胞AQP1、AQP3 和AQP4 表達增加，在脊髓損傷后4 周內持續存在。脊髓損傷后結腸AQPs 高表達，有利于水分通過腸壁黏膜。這種通透性變化對水轉運是雙向的，可以解釋脊髓損傷患者易出現大便干硬。同時，對瀉藥高度敏感，易導致腹瀉[32]。

脊髓損傷導致結腸AQPs 升高的原因尚不清楚。結腸AQPs 的表達受很多因素影響。滲透性瀉藥硫酸鎂通過增加細胞內Mg2+，激活腺苷酸環化酶，增加結腸AQP3 的表達；刺激性瀉藥比沙可啶能降低結腸黏膜上皮細胞AQP3的表達水平[32]。Itoh等[33]的實驗證明血管活性腸肽通過cAMP依賴通路調節AQP3的表達，影響腸道分泌，與便秘關系密切。在腸易激綜合征患者中也觀察到5‐羥色胺(5‐hydroxytryptamine,5‐HT)的釋放量增加，提示炎癥及機械刺激也可促進嗜鉻細胞分泌5‐HT[34]。結腸黏膜中較高的5‐HT水平可增 加AQP3 的表達，促進水從管腔運輸至血管側面，導致大便硬化[35‐37]。

脊髓損傷后血管自主神經失調，遠端結腸腸系膜動脈基礎血灌注減少，結腸炎性因子表達上調[38]。由于腸道運動減慢，糞便長期滯留，結腸內炎性因子異常積累，腸道菌群增殖移位，進一步加重腸道慢性炎癥的發生[39]。本研究中，脊髓損傷組結腸組織有炎性細胞浸潤。因此，脊髓損傷后結腸炎癥可能是導致腸黏膜AQPs異常表達的重要因素。

脊髓損傷后，由于失去中樞神經系統控制，各種組織的自主神經受體表達和反應性在損傷水平以下經常發生改變，自主神經回路發生重組[40]。腸道內受體表達和激素分泌也會發生適應性改變[41‐42]，這也可能導致AQPs的異常表達。

目前對脊髓損傷后腸道功能障礙的研究多關注腸道動力下降，結腸傳輸時間延長[43‐44]，糞便干硬，便秘嚴重。盡管脊髓損傷組和正常組結腸傳輸時間有差異，但我們通過在相同時間段內測定兩組糞便含水率和AQPs 的變化，可以有效消除傳輸時間不同造成的影響。本研究結果顯示，脊髓損傷后大鼠結腸黏膜AQPs 高表達，至少持續到4 周，且AQPs 過度表達與結腸糞便含水率有顯著相關性，提示除腸道運動減慢、結腸傳輸時間延長外，結腸AQPs 的過度表達可能也是加重大鼠脊髓損傷后便秘的原因之一。

本研究尚有一些不足之處。研究周期較短，未對脊髓損傷后腸道AQPs變化進行長期觀察。AQPs在結腸黏膜中的表達變化是本研究的重點，而其在脊髓損傷后的變化機制仍需進一步探討。

綜上所述，我們首次觀察到脊髓損傷可導致大鼠結腸AQPs 過表達，與脊髓損傷后結腸水分過度吸收有關。本研究具有一些潛在臨床優勢可為脊髓損傷患者的便秘治療提供研究方向。