白楊素固體脂質(zhì)納米粒水凝膠骨架緩釋片的制備

李宏偉付金芳范明松

（1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州450005； 2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州450064； 3.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術(shù)中心，上海201401）

白楊素主要是從紫葳科植物木蝴蝶Oroxylum indicum（Linn.）Kurz中提取出的一種活性成分，屬于黃酮類化合物，具有多種藥理活性，比如抗腫瘤、抗炎、抗心律失常、降血壓等［1-3］，對動脈粥樣硬化、高血壓等心腦血管疾病有明顯的預(yù)防、治療作用［4］，但其水溶性較差［5-6］，導(dǎo)致生物利用度很低。課題組［7］前期曾采用固體脂質(zhì)納米粒技術(shù)改善白楊素體內(nèi)吸收，極大提高了其生物利用度，但血藥濃度仍較大［8-9］，故有必要聯(lián)用緩控釋技術(shù)加以改善。

水凝膠骨架緩釋片一般采用親水性高分子羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）作為骨架材料，制備工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，是緩釋制劑研究的熱點之一［10-11］。本實驗首先采用凍干保護劑將白楊素固體脂質(zhì)納米粒制備成凍干粉末，然后選擇HPMC 作為緩釋材料，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作為緩釋片釋藥速率調(diào)節(jié)劑，進一步制成具有緩釋特征的水凝膠骨架緩釋片，以期為相關(guān)制劑革新提供參考。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；PB203-N 型電子分析天平［梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司］；TF-86-200-WA 型超低溫冰箱（上海田楓實業(yè)有限公司）；Mastersizer 3000E 型激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；BP-8170-B 型手搖單沖壓片機（河南寶品科技有限公司）；LGJ-10 型冷凍干燥機（北京松原華興科技發(fā)展有限公司）；ZRS8G 型智能溶出試驗儀（上海雙旭電子有限公司）。

1.2 試劑與藥物 白楊素原料藥（批號161018001，純度＞98%，河南萊爾茵科技有限公司）；白楊素對照品（批號 20161025，純度99.3%，上海源葉生物有限公司）。蔗糖（西安悅來醫(yī)藥科技有限公司）；淀粉（批號20170620，曲阜市藥用輔料有限公司）；甘露醇（批號M160525，法國羅蓋特公司）；乳糖（批號56522108，上海宏運實業(yè)有限公司）；羥丙基甲基纖維K15M（HPMC K15M，批號SH234187，上海卡樂康公司）；泊洛沙姆 188（F68，批號WPMD507C，德國BASF 公司）、Tween-80（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；卵磷脂（批號PC20170510，鄭州明欣化工產(chǎn)品有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號P20160517，上海金錦樂實業(yè)有限公司）；硬脂酸鎂（批號151026，曲阜市天利藥用輔料有限公司）。磷酸為色譜純（批號C10197679，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈為色譜純（德國Merck 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白楊素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.15%磷酸（28∶72）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長222 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取白楊素對照品10.44 mg，轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，70 mL 乙腈超聲處理20 s，靜置0.5 h 后定容并混勻，精密量取適量，流動相逐步稀釋成0.104、0.52、1.04、5.22、10.44、26.10 μg／mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝15.236 4X＋0.923 1（r＝0.999 8），在0.104～26.10 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取固體脂質(zhì)納米粒混懸液1.0 mL 于100 mL 量瓶中，乙腈超聲處理5 min 進行破乳，放置30 min 后流動相定容混勻，取1 mL 上清液，加入1 mL 流動相混勻，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 選擇 26.10、10.44、0.104 μg／mL作為白楊素高、中、低質(zhì)量濃度，日內(nèi)精密度RSD 分別為0.51%、0.67%、0.86%，日間精密度RSD 分別為0.94%、0.38%、0.55%；供試品溶液在0、1、2、3、4、5 d 內(nèi)峰面積無明顯變化，表明在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好；平均加樣回收率分別為99.68%（RSD＝0.51%）、100.38%（RSD＝0.93%）、100.09%（RSD＝0.99%）。

2.2 固體脂質(zhì)納米粒制備［7］采用乳化超聲-低溫固化法，整個操作過程注意避光。稱取白楊素30 mg、單硬脂酸甘油酯250 mg、大豆卵磷脂50 mg，置于10 mL 無水乙醇中，水浴加熱至（75±1）℃，攪拌溶解，作為油相；稱取Tween-80、F68 各80 mg，溶于20 mL 蒸餾水中，水浴加熱至（75±1）℃，攪拌溶解，作為水相，將油相緩慢滴入水相中，并繼續(xù)攪拌使混懸液體積濃縮至約10 mL，作為初乳，繼續(xù)超聲（800 W，每6 s 間隔3 s）處理10 min 后，置于-20 ℃冰箱中固化，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 包封率、載藥量、粒徑測定 避光條件下精密量取2.0 mL 固體脂質(zhì)納米粒混懸液，加到超濾離心管（10 kD）內(nèi)管中，12 000 r／min 離心60 min，取超濾離心管外管濾液適量，HPLC 法測定游離白楊素含有量（m游離）。取同體積固體脂質(zhì)納米粒混懸液，置于10 mL 量瓶中，加入乙腈，超聲法破壞納米粒，定容至刻度，計算納米粒中白楊素含有量（m總）。然后，根據(jù)課題組前期報道的方法［7］測定包封率、載藥量，測得兩者分別為80.57%、6.04%。

納米粒混懸液用蒸餾水稀釋后，測定其粒徑分布情況，結(jié)果見圖1，可知平均粒徑為（215.84±16.38）nm。另外，納米粒PDI 為0.108±0.025。Zeta 電位為-（21.61±2.34）mV。

圖1 固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of solid lipid nanoparticles

2.4 水凝膠骨架緩釋片制備 按100 片量進行制備，每片取納米粒混懸液9.1 mL（含藥量2.75 mg／mL），加入凍干保護劑（蔗糖、乳糖、甘露醇）350 mg／片，-80 ℃下預(yù)凍后冷凍干燥。取過80 目篩的納米粒凍干粉末、HPMC 15K、PEG，充分混勻。加入適量6%淀粉漿制軟材，20 目篩制粒，45 ℃真空干燥24 h，過20 目篩整粒，加入適量硬脂酸鎂，充分混勻后壓片［壓力（50±10）N］，即得。該緩釋片直徑為1.1 cm，形狀為圓形，片重約為0.5 g（輔料用量考察時會發(fā)生變化），含藥量約為25 mg／片。

2.5 釋放度測定 采用轉(zhuǎn)籃法測定。取適量緩釋片，以900 mL 經(jīng)超聲波法處理的1.0%SDS 溶液為釋放介質(zhì)，溫度（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速75 r／min，預(yù)定時間點取樣3 mL，補加同體積蒸餾水，精密量取2 mL，同時加入1.0 mL 乙腈，稱定質(zhì)量，超聲處理30 s，乙腈補充減失的質(zhì)量，作為供試品溶液，濾過，HPLC 法測定白楊素含有量。計算各取樣時間點累積釋放度，繪制體外釋藥曲線。

2.6 單因素試驗

2.6.1 凍干保護劑種類 設(shè)定HPMC K15M 用量為50 mg／片，PEG 4000 用量為30 mg／片，硬脂酸鎂用量為片芯質(zhì)量的1.0%，考察蔗糖、乳糖、甘露醇對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，甘露醇、乳糖作為凍干保護劑時凍干粉外觀、色澤、再分散性較優(yōu)，而蔗糖相對較差；制成緩釋片后，片劑外觀依次為乳糖＞甘露醇＞蔗糖，釋藥速率依次為甘露醇＞乳糖＞蔗糖，由于釋藥速率可通過骨架材料及PEG 種類、用量來調(diào)節(jié)，故選擇乳糖作為凍干保護劑。

圖2 凍干保護劑種類對藥物釋放的影響Fig.2 Effect of freeze-drying protective agent kind on drug release

然后，取凍干粉約10 mg，加入5 mL 蒸餾水振蕩復(fù)溶，0.45 μm 微孔濾膜過濾，測定其粒徑分布情況，結(jié)果見圖3，可知平均粒徑為（303.76±18.34）nm。另外，凍干粉PDI 為0.152±0.036，Zeta 電位為-（18.17±1.64）mV，與固體脂質(zhì)納米粒比較，平均粒徑有增大趨勢，而Zeta 電位絕對值有減小趨勢。

圖3 凍干粉粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of freeze-dried powder

2.6.2 HPMC 15K 用量 選擇HPMC 15K 作為緩釋材料，乳糖作為凍干保護劑，設(shè)定PEG 4000 用量為30 mg／片，硬脂酸鎂用量為片芯質(zhì)量的1.0%，考察HPMC 15K 用量40、50、60 mg／片對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，隨著HPMC 15K 用量增加，釋藥速率、12 h 內(nèi)累積釋放度逐漸下降。

2.6.3 PEG 型號 選擇乳糖作為凍干保護劑，設(shè)定HPMC K15M 用量為50 mg／片，PEG 用量為30 mg／片，硬脂酸鎂用量為片芯質(zhì)量的1.0%，考察PEG 400、PEG 4000、PEG 10000 對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖5。由此可知，釋藥速率隨著PEG分子量升高而逐漸變慢，故選擇PEG 400、PEG 4000聯(lián)合使用。

圖4 HPMC 15K 用量對藥物釋放的影響Fig.4 Effect of HPMC 15K consumption on drug release

圖5 PEG 型號對藥物釋放的影響Fig.5 Effect of PEG type on drug release

2.6.4 PEG 400 與PEG 4000 比例考察 選擇乳糖作為凍干保護劑，設(shè)定HPMC K15M 用量為50 mg／片，PEG 用量為30 mg／片，硬脂酸鎂用量為片芯質(zhì)量的1.0%，考察PEG 400 與PEG 4000 比例1∶2、1∶1、2∶1 對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖6。由此可知，隨著兩者比例升高，釋藥速率呈增加趨勢。

圖6 PEG 400 與PEG 4000 比例對藥物釋放的影響Fig.6 Effect of PEG 400-PEG 4000 ratio on drug release

2.6.5 PEG 用量 選擇乳糖作為凍干保護劑，設(shè)定HPMC K15M 用量為50 mg／片，硬脂酸鎂用量為片芯質(zhì)量的1.0%，PEG 400 與PEG 4000 比例為2∶1，考察PEG 用量20、25、30 mg 對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖7。由此可知，隨著PEG 用量升高，釋藥速率逐漸變快。

圖7 PEG 用量對藥物釋放的影響Fig.7 Effect of PEG consumption on drug release

2.6.6 硬脂酸鎂用量 選擇乳糖作為凍干保護劑，設(shè)定HPMC K15M 用量為50 mg／片，PEG 400 與PEG 4000 比例為2∶1，PEG 用量為30 mg／片，考察硬脂酸鎂用量0.5%、1.0%、1.5% 對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖8。由此可知，隨著硬脂酸鎂用量升高，釋藥速率逐漸下降。

圖8 硬脂酸鎂用量對藥物釋放的影響Fig.8 Effect of magnesium stearate consumption on drug release

2.7 正交試驗 根據(jù)“2.6”項下單因素試驗結(jié)果，選擇HPMC K15M 用量（A）、PEG 400 與PEG 4000 比例（B）、PEG 用量（C）、硬脂酸鎂用量（D）作為影響因素，L9（34）正交試驗優(yōu)化處方，因素水平見表1，結(jié)果見表2。水凝膠骨架緩釋片在初始階段的累積釋放度（L2h）表示是否存在時滯或突釋情況，中間階段的累積釋放度（L6h）表示是否存在釋放不足或過度釋放情況，最后階段的累積釋放度（L12h）表示是否釋放完全，綜合評分L＝｜L2h-0.25 ｜ ×100×1 ＋｜L6h-0.60 ｜×100×1＋｜L12h-0.95 ｜ ×100×2，以最低者為優(yōu)。方差分析見表3。

由此可知，各因素影響程度依次為A＞C＞B＞D，其中因素A有明顯影響（P＜0.05）；最優(yōu)處方為A2B1C3D1，即HPMC K15M 用量50 mg，PEG 400與PEG 4000 比例2∶1，PEG 用量30 mg，硬脂酸鎂用量0.5%。

然后，取緩釋片體外釋放樣品，0.45 μm 微孔濾膜過濾后測得平均粒徑為（553.44±25.96）nm，PDI 為0.318±0.067，其中前者變大，可能與壓片過程中納米粒受到擠壓而發(fā)生形變有關(guān)；Zeta 電位為-（17.36±1.92）mV，略低于凍干粉，表明制成緩釋片后仍有部分藥物以納米粒形式從中釋放。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.8 驗證試驗及釋藥機制研究 按“2.7”項下最優(yōu)處方制備3 批緩釋片。按“2.5”項下方法測定釋放度，結(jié)果見圖9。由此可知，該工藝重復(fù)性良好，水凝膠骨架緩釋片12 h 內(nèi)累積釋放度為93.19%。

然后，對水凝膠骨架緩釋片釋藥情況進行擬合，結(jié)果 見表4，可知其符合一級方程（r＝0.994 1），而且機制可由Ritger-Pepps 方程描述。對于圓柱形片劑而言，0.45＜n＜0.89 時為擴散與溶蝕協(xié)同作用，而本實驗測得n為0.782 6，可知水凝膠骨架緩釋片體外釋藥與上述作用一致。

圖9 水凝膠骨架緩釋片體外釋藥曲線Fig.9 In vitro drug release curves for hydrogel matrix sustained-release tablets

表4 模型擬合結(jié)果Tab.4 Results of model fitting

3 討論

納米制劑在促進藥物吸收的同時，容易導(dǎo)致血藥濃度波動較大，故控制納米粒在體內(nèi)緩釋越來越受到相關(guān)學(xué)者的關(guān)注［10-11］。前期報道［12］，雙層滲透泵制劑技術(shù)可有效控制納米粒緩慢釋放，但它包有含藥層、助推層、包衣膜等，制備工藝復(fù)雜；水凝膠骨架緩釋片制備工藝簡單［13-15］，容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此本研究采用該技術(shù)將白楊素固體脂質(zhì)納米粒制成緩釋片，而且并未除去混懸液中的游離藥物，故緩釋片中大部分是以納米粒狀態(tài)存在，少部分以游離狀態(tài)存在。研究表明［16］，膠體溶液中游離藥物可不采取分離措施，它與納米粒中藥物處于動態(tài)平衡，若分離前者可能會導(dǎo)致納米粒中藥物釋放出來；膠體溶液制備凍干粉時可使游離藥物吸附于納米粒，有助于增加后者負載量；緩釋片釋放度的測定方法并未區(qū)分游離藥物和納米藥物，而是針對各時間點兩者總釋放度，由于兩者體內(nèi)吸收情況差別較大，故本實驗所得緩釋片的體內(nèi)藥動學(xué)還需進一步結(jié)合動物實驗研究。

目前，白楊素市售品大多為保健品，比如白楊素膠囊、蜂膠軟膠囊、蜂膠葛根軟膠囊等［17-18］，每天劑量一般在14.4～50.0 mg 之間，而本實驗制備的緩釋片劑量約為25 mg／片。另外，緩釋片劑量調(diào)整可通過改變骨架材料、PEG 用量來實現(xiàn)，今后將研究該劑量是否合適、在比格犬體內(nèi)藥動學(xué)等，以期為相關(guān)新型保健品或制劑的開發(fā)提供借鑒。