一測多評法同時測定十味香鹿膠囊中5 種人參皂苷

張凱月李志成張 曄汪 濤努力扎黑沙甫張 輝

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春130117）

十味香鹿膠囊是長春中醫(yī)藥大學(xué)針對乳腺增生病癥自主研發(fā)的上市新藥，由人參、香附、鹿角脫盤等10 味藥材組成，具有疏肝解郁、軟堅散結(jié)等功效，主治肝郁兼痰凝證所致乳腺疾病［1］。方中人參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是人參皂苷，對垂體-性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能具有調(diào)節(jié)作用，能興奮垂體分泌促性腺激素，促進DNA、蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶蛋白的生物合成，使性腺活性增加，通過對垂體-性腺軸的雙向調(diào)節(jié)作用，平衡神經(jīng)內(nèi)分泌的正負反饋功能，從而降低異常增高的雌二醇，并使卵巢激素控制的乳腺細胞增生得到抑制，故建立與本品藥效相關(guān)的人參皂苷質(zhì)量控制方法具有重要意義。目前，十味香鹿膠囊質(zhì)量標準制定了人參、莪術(shù)、蜈蚣、浙貝母TLC 定性鑒別，以及浙貝母中貝母素甲，人參中人參皂苷Rb1、Re、Rg1定量測定，但尚未進行一測多評測定。

由于對照品在質(zhì)量控制中的稀缺性與昂貴性，故一測多評廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制標準的建立［2-4］，它是根據(jù)中藥各成分比例關(guān)系選擇某一內(nèi)在成分作為內(nèi)標，通過測定內(nèi)標與其他成分之間的相對校正因子計算含有量，從而減少對照品使用量，降低成本［5-6］。2015 年版《中國藥典》 中人參皂苷Rb1作為人參檢測指標，它含有量高，對照品易得［7］，故本實驗選擇其作為內(nèi)標，計算十味香鹿膠囊中人參皂苷Rb3、Re、Rf、Rg1含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；WP-UP-III-40 型超純水系統(tǒng)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。人參皂苷Rb1、Rb3、Re、Rf、Rg1對照品（批號分別為110704-201827、111686-201504、110754-201827、111719-201505、110703-201128）購于中國食品藥品檢定研究院。十味香鹿膠囊（每粒重0.5 g，批號分別為181001、181002、190101、190102、190501、190502）購于吉林華康藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Agilent EC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～60 min，19%～30%A；60～120 min，30%～50%A）；體積流量0.5 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長203 nm；進樣量3 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品人參皂苷Rb12.04 mg、Rb32.04 mg、Re 2.02 mg、Rf 2.02 mg、Rg12.01 mg，少量甲醇溶解定容至10 mL 量瓶中，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末（過四號篩），精密稱取1.000 2 g 至50 mL EP 管中，30 mL 甲醇超聲（250 W、50 kHz）處理1 h，過濾，蒸干，蒸干物溶于少量水中，二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各20 mL 依次萃取3 次，合并上層萃取液，蒸干，甲醇溶解定容至5 mL 量瓶中，即得。

2.2.3 陰性樣品（缺人參）溶液 將蜈蚣研磨成細粉狀，精密稱取1.002 5 g；取香附50.002 8 g、莪術(shù)30.012 4 g、薤白30.011 3 g，加4 倍量水，水蒸氣蒸餾法提取6 h 得到揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另外收集；取鹿角脫盤3.012 2 g、鱉甲3.002 4 g，加6 倍量水煎煮6 h，煎液另外收集；取浙貝母6.024 1 g、天冬6.012 5 g、桔梗3.002 6 g，與上述藥渣合并，4 倍量水煎煮3 次，每次2 h，濾過，濾液與收集的水溶液合并，濃縮至相對密度1.21～1.25（80 ℃），加無水乙醇使其含醇量達70%，靜置24 h，濾過，濃縮成相對密度1.21～1.25（80 ℃）的稠膏，加入蜈蚣細粉，置通風(fēng)處干燥，研磨成細粉，與揮發(fā)油混勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗與專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣3 μL 測定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 吸取“2.2.1”項下對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各人參皂苷在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3峰面積RSD 分別為1.23%、2.46%、1.42%、1.83%、1.79%，表明儀器精密度良好。

圖1 各人參皂苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various ginsenosides

表1 各人參皂苷線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various ginsenosides

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3峰面積 RSD 分別為 1.49%、1.04%、1.39%、1.36%、1.75%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取本品（批號190502），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3含有量 RSD 分別為1.82%、1.43%、1.89%、2.00%、1.92%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取含有量已知的本品（批號190502），研成細粉，平行精密稱取6 份，分別 為0.200 4、0.200 8、0.200 6、0.200 4、0.200 3、0.200 2 g，按1∶1 比例加入對照品溶液，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各人參皂苷加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various ginsenosides（n＝6）

2.3.7 相對校正因子測得［8-9］吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以人參皂苷Rb1為內(nèi)標，分別采用斜率法、多點校正法［10-11］計算其他4 種人參皂苷的相對校正因子（f），結(jié)果見表3，可知2 種方法所得結(jié)果接近［相對誤差（RE）＜3.0%］。

表3 各人參皂苷相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various ginsenosides

2.3.8 色譜峰定位［12］以人參皂苷Rb1為內(nèi)標，測定其他4 種人參皂苷的相對保留值（RT）以定位色譜峰，結(jié)果見表4，可知定位重復(fù)性良好。

2.4 耐用性試驗

2.4.1 相對校正因子 吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，多點校正法考察Agilent 1260、Agilent 1100 Series色譜儀，以及Agilent EC-C18、Zorbax SB-C18、Extend-C18色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響。

表4 各人參皂苷相對保留值（n＝6）Tab.4 Relative retention values of various ginsenosides（n＝6）

表5 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2 色譜峰定位 按“2.3.8”項下方法考察“2.4.1”項下儀器、色譜柱對相對保留值的影響，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響。

表6 不同儀器、色譜柱對相對保留值的影響Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative retention values

2.5 樣品含有量測定 取6 批本品，按“2.2.2”項下方法各平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法和一測多評法計算含有量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果相近［相對誤差（RE）＜3.0%］。

3 討論

3.1 供試品溶液制備 十味香鹿膠囊由10 味藥材組成，成分復(fù)雜，考察各人參皂苷含有量時常伴有其他組分干擾，故供試品溶液制備是定量測定的關(guān)鍵因素。本實驗采用不同極性的溶劑（如二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等）以除去極性較低的脂溶性雜質(zhì)，以及極性較高的水溶性雜質(zhì)，與《中國藥典》 方法相比色譜峰分離度高，峰形良好。

3.2 一測多評法測定［13］本實驗分別采用多點校正法和斜率法對一測多評法所得相對校正因子進行比較，發(fā)現(xiàn)RE＜3.0%，表明2 種方法無明顯差異。另外，RTRi／s在給定的條件下相對穩(wěn)定，可作為初步定位的依據(jù)。

表7 各人參皂苷含有量測定結(jié)果（mg／粒， n＝6）Tab.7 Results of content determination for various ginsenosides（mg／capsule， n＝6）

4 結(jié)論

本研究建立一測多評法同時測定十味香鹿膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3的含有量，該方法操作簡單，穩(wěn)定可靠，解決了相關(guān)對照品缺失、成本高昂等問題，從而更有效地控制該制劑質(zhì)量。