孕康口服液3 種成分測定及HPLC 指紋圖譜建立

余歡歡黃啟迪顏美秋笈文娜陳建真呂圭源

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州310053）

孕康口服液是由山藥、續斷、黃芪、當歸、黃芩、白芍等藥材組成的中藥復方制劑，收載于2015 年版《中國藥典》一部，功效健脾固腎、養血安胎，主要用于腎虛型、氣血虛弱型先兆流產和習慣性流產。《中國藥典》 報道通過HPLC 法對方中芍藥苷、黃芩苷含有量分別進行測定［1］，但兩者采用不同流動相體系，而且缺少君藥有效成分的定量分析及整體質量控制，顯得不夠全面，而且操作也繁瑣復雜。

續斷作為孕康口服液君藥，具有補肝腎、續筋骨、調血脈功效，川續斷皂苷Ⅵ是其主要有效成分，能保護骨組織［2-4］、肝臟［5-6］、心肌［7］、神經系統［8-9］等；并可促進孕酮受體表達，從而起到維持懷孕的作用［10］。因此，本實驗選擇該成分及《中國藥典》 中黃芩苷、芍藥苷作為指標，同時測定三者含有量，并建立孕康口服液HPLC 指紋圖譜，以期為提升該制劑質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試劑與藥物 川續斷皂苷Ⅵ、黃芩苷、芍藥苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為Z18M10L83256、P20A9F59353、L07M9Q60533，純度≥98%）。16 批孕康口服液購自杭州不同藥店，其中13 批為孕康口服液（回音必集團浙江齊齊制藥有限公司，棕色，10 mL／支，編號S1～S13），3批為孕康口服液（江西濟民可信制藥有限公司，棕色，20 mL／支，編號S14～S16）。山藥、黃芪、當歸、狗脊（去毛）、菟絲子、桑寄生、杜仲（炒）、補骨脂、黨參、茯苓、白術（焦）、阿膠、地黃、山茱萸、枸杞子、烏梅、砂仁、益智、苧麻根、艾葉均購于浙江天冉中藥飲片有限公司，經浙江中醫藥大學陳孔榮教授鑒定為正品。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，均購于華東醫藥股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 含有量測定

2.1.1 色譜條件及系統適應性試驗 Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，13% A；15～60 min，13%～40% A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長230 nm（0～20 min，芍藥苷）、316 nm（20～45 min，黃芩苷）、212 nm（45～60 min，川續斷皂苷Ⅵ）；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。在此條件下，各成分色譜峰均能達到基線分離，理論塔板數按各成分計均不低于2 000。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品芍藥苷4.2 mg、黃芩苷4.9 mg、川續斷皂苷Ⅵ3.2 mg，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，即得（質量濃度分別為84.0、98.0、64.0 μg／mL）。

2.1.2.2 供試品溶液 精密移取0.5 mL 本品，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝分別制備缺白芍、黃芩、續斷的陰性樣品，按“2.1.2.2”項下方法制備，即得。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于5 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.1.3.2 專屬性考察 吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.1.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得芍藥苷、黃芩苷、川續斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 分別為0.45%、0.42%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號18051211），于0、3、6、9、12、15 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、黃芩苷、川續斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 分別為1.07%、0.65%、2.08%，表明溶液在15 h 內穩定性良好。

2.1.3.5 重復性試驗 精密吸取同一批本品（批號18051211）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得芍藥苷、黃芩苷、川續斷皂苷Ⅵ含有量RSD 分別為1.18%、1.17%、2.49%，表明該方法重復性良好。

2.1.3.6 加樣回收率試驗 精密移取含有量已知的本品（批號18051211）0.35 mL 于25 mL 量瓶中，精密加入5 mL 對照品溶液，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.1.1”色譜條件項下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.1.4 樣品含有量測定 精密吸取不同批次本品適量，置于10 mL 量瓶中，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含有量測定結果Tab.3 Results of content determination for various constituents

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 溶液制備 同“2.1.2”項。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號18051211），在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得相似度均為1.000，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號18051211），于0、3、6、9、12、15 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得相似度均高于0.999，表明溶液在15 h 內穩定性良好。

2.2.3.3 重復性試驗 精密吸取同一批本品（批號18051211），按“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得相似度均高于0.999，表明該方法重復性良好。

2.2.4 指紋圖譜生成 取 16 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，再將相關數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）”進行分析，結果見圖2。

圖2 16 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for sixteen batches of samples

2.2.5 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）”進行相似度評價，結果見表4。由此可知，A 廠家13 批樣品相似度整體較高，均高于0.981，故對其作進一步考察；B 廠家3 批樣品相對較低，在0.944～0.954 之間。

2.2.6 共有峰指認 各成分色譜峰在60 min 內全部出現，本實驗將峰面積較大、分離度較好者進行標定，共發現13 個共有峰，再采用中位數法，經多點校正后生成對照圖譜，見圖3。通過與對照品比較發現，5、8、12 號峰分別為芍藥苷、黃芩苷、川續斷皂苷Ⅵ，保留時間分別為14.1、38.0、48.3 min，其中8 號峰分離度、峰形較好，出峰時間居中，峰面積較大，故選擇其作為參照峰，標號為8（S），計算其他共有峰相對保留時間、峰面積，結果分別見表5～6。

表4 16 批樣品相似度Tab.4 Similarities of sixteen batches of samples

3 討論

為了進一步提升孕康口服液質量標準，本實驗選擇芍藥苷、黃芩苷、川續斷皂苷Ⅵ作為檢測指標，參考文獻［1，11-13］，通過梯度洗脫結合波長切換建立三者含有量同時測定的方法。2015 年版《中國藥典》 報道，芍藥苷、黃芩苷、川續斷皂苷Ⅵ檢測波長分別為230、280、212 nm，而本實驗發現在280 nm處黃芩苷峰面積較高，導致川續斷皂苷Ⅵ峰高在整體譜圖中偏低；由于黃芩苷在316 nm 處也有吸收，而且強度僅次于280 nm［14］，故選擇316 nm 作為其檢測波長。

含有量測定結果顯示，不同廠家、批次孕康口服液中各成分含有量存在差異，可能是由于原藥材產地、采收季節等因素所致。2015 年版《中國藥典》 規定，孕康口服液中芍藥苷、黃芩苷含有量分別不得低于0.25、0.8 mg／mL，由此可知，本實驗中16 批樣品均達標。

圖3 各成分對照圖譜Fig.3 Reference chromatogram of various constituents

表5 13 批樣品相對保留時間Tab.5 Relative retention time for thirteen batches of samples

表6 13 批樣品相對峰面積Tab.6 Relative peak areas for thirteen batches of samples

建立孕康口服液HPLC 指紋圖譜時發現，回音必集團浙江亞東制藥有限公司生產的13 批樣品相似度均大于0.981，而江西濟民可信藥業有限公司生產的3 批樣品均大于0.944，表明各批次樣品間相似度較高，質量穩定。

綜上所述，本實驗所采用的多指標含有量測定結合HPLC 指紋圖譜可用于孕康口服液整體質量控制，而且該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性良好，可為該制劑質量標準提升提供參考。