三益丹對大鼠心肌缺血的改善作用

田 歡支文冰李 曄張 紅陳志永劉 洋胡 靜岳寶森趙 鋒?

（1.西安市中醫醫院 藥劑科，陜西 西安710021； 2.陜西省中醫藥研究院 中藥研究所，陜西西安710003）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CAHD）是指冠狀動脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，因冠狀動脈功能性改變（痙攣）導致心肌缺血、缺氧或壞死而引起的以胸痛、胸悶、短氣等主要臨床癥狀的心臟病，是心腦血管疾病里常見的一種。冠心病最主要的病變基礎是冠狀動脈供血不足導致的心肌缺血，而心肌則因缺血發生各種病理改變，急劇、短暫的缺血可引起心絞痛，持續、嚴重的心肌缺血則可引起心肌壞死［1］。現代醫學理論中所說的冠心病、心絞痛、心肌梗死，屬于中國傳統醫學理論中的胸痹、心痛和真心痛的范圍［2］。三益丹是西安市中醫醫院傳統制劑，由人工牛黃、血竭、西洋參、延胡索、薄荷冰、冰片、硼砂、生石膏、人工麝香、珍珠粉十味藥材組成的成方制劑，臨床主要用于心血瘀阻引起的心前區悶痛不適（心絞痛），在臨床應用已有四十多年，且療效顯著［3］。方中人工牛黃、麝香、薄荷冰、冰片開竅化濁［4-5］；延胡索、血竭活血化瘀，行氣止痛；石膏清熱瀉火；珍珠粉鎮心安神；西洋參補益心脾［5］。諸藥合用，共奏“三益”之效，故名三益丹，三益丹具有益氣養陰、通痹止痛、開竅化濁的功效。本研究擬用鹽酸異丙腎上腺素誘導，復制大鼠心肌缺血模型，進而驗證三益丹可緩解心血瘀阻型心前區悶痛不適的臨床療效。

1 材料

1.1 藥物和試劑 三益丹（自制）方中人工牛黃2.5 g、血竭1.5 g、西洋參5 g、延胡索6 g、薄荷冰9 g、冰片2 g、硼砂7.5 g、生石膏30 g、人工麝香0.4 g、珍珠粉4 g，上述十味藥材，均由陜西興盛德中藥飲片公司提供，陜西省中醫藥研究所張紅研究員鑒定為合格飲片。實驗室經過前期的工藝優化，按處方比例取方中各藥材，以總處方8%聚維酮（PVP-K30）為黏合劑，6% 羧甲基淀粉鈉（CMS-Na）為崩解劑，水為潤濕劑，一定比例充分混合均勻，制備軟材后，采用擠出滾圓法，制備出丸重為41.23 mg，大小均一，工藝穩定，質量可控的三益丹丸劑；復方丹參滴丸（天士力醫藥集團股份有限公司，批號180320）。鹽酸異丙腎上腺素（isproterenol，ISO；上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號L1708046）；生理鹽水注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號N18052508-2）；烏來糖（國藥集團化學試劑有限公司，批號20180308）；多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號20180308）；MDA（批號S0131）、NO（批號S0021）、IL-6（批號133141051126）、TNFα（批號240141131126）檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；CTn-I（批號190123031）、CK（批號190345121）、LDH（批號190840268）、AST（批號190940023）測定試劑盒（寧波普瑞柏生物技術股份有限公司）。

1.2 動物 雄性SD 大鼠60 只，體質量（220±20）g，購于西安交通大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（陜）2012-003。在標準實驗條件下，溫度（25±2）℃、相對濕度（60±5）%適應性飼養1 周。

1.3 儀器 ECG-6511 十二導心電圖機（上海光電醫用電子儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；酶標儀（伯樂醫學產品有限公司）；Abbott i2000（雅培制藥有限公司）、Series 7600 生化儀（日本日立公司）；高速冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）；RM2235 組織切片機（德國徠卡公司）；HD-330 型攤片烤片機（湖北慧達儀器有限公司）；E200 顯微鏡（尼康影像儀器有限公司）；雅博包埋機（常州市雅博電子設備有限公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 將60 只SD 大鼠隨機分為正常組，模型組，復方丹參滴丸組（85 mg／kg）、三益丹低、中、高劑量組（37.5、75.0、150.0 mg／kg）。每組大鼠連續灌胃給藥14 d，1 次／d，正常組和模型組給予等量的生理鹽水。第12～14 天，灌胃給藥30 min 后，除正常組外，其他各組大鼠背部皮下多點注射ISO（85 mg／kg），1 次／d，連續注射3 d，時間間隔為24 h，正常組注射等量的生理鹽水，構建大鼠心肌缺血模型［7］。三益丹丸臨床用藥量為成人每日900 mg；本研究依據陳奇主編的《中藥藥理實驗方法學》，大鼠（200 g）體表面積與成人（70 kg）體表面積比為0.018；75 mg／kg作為本研究的中劑量組，并分別減小和增大一倍得低、高劑量組（37.5、150 mg／kg）。

2.2 心肌缺血大鼠心電圖監測 末次皮下注射ISO 前，20%烏來糖麻醉各組大鼠，行肢體Ⅱ導心電圖檢查，記錄大鼠心電圖，觀察ST 段的變化。

2.3 心肌組織病理學檢查 心電圖監測完成后，繼續觀察30 min，經腹部正中線切開，打開腹腔，立即取下心臟，生理鹽水中涮洗干凈，取左心尖組織，置于裝有4% 多聚甲醛溶液的離心管中固定48 h，采用HE 染色法觀察心肌組織的病理學變化情況。

2.4 大鼠血清因子檢測 心電圖監測完成后，繼續觀察30 min，經腹部正中線切開，打開腹腔，大鼠腹主動脈采血，至無菌試管中，靜置2 h，3 500 r／min離心10 min，分離血清。

NO、MDA、TNF-α、IL-6 檢測，按照各試劑盒說明書中描述的方法操作，利用酶標儀檢測血清中各指標成分的活；肌鈣蛋白（cTn）采用Abbott i2000 生化分析儀測定，CK、LDH、AST 采用Series 7 600 分析儀測定。

2.5 統計學分析 實驗數據采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 心肌缺血大鼠心電圖 ISO 誘導前各組大鼠心電圖ST 段比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。誘導后，正常組大鼠心電圖ST 段較之前無變化，與正常組比較，模型組大鼠ST 段值升高（P＜0.01）；與模型組比較，三益丹組大鼠心電圖ST段值降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 三益丹對心肌缺血大鼠心電圖ST 段的影響Fig.1 Effects of Sanyidan on ST segment of myocardial ischemic rats

圖2 各組大鼠心電圖Fig.2 Electrocardiogram for rats of each group

3.2 心肌組織病理學 正常組心肌細胞橫紋清楚，排列有序，無炎性細胞浸潤及細胞壞死等病變；模型組橫紋模糊，排列紊亂，大量炎性細胞浸潤，細胞核減少，心肌組織損傷嚴重；復方丹參滴丸組、三益丹低、中、高劑量組均可看到較少量炎性細胞浸潤和不同程度細胞壞死現象。見圖3。

3.3 大鼠血清中cTn-I 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中cTn-I 水平升高（P＜0.01）。而給予復方丹參滴丸及不同劑量的三益丹進行預保護，大鼠血清cTn-I 水平均下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

圖3 各組HE 染色結果（HE，×10）Fig.3 Resultant HE staining for each group（HE，×10）

圖4 三益丹對心肌缺血大鼠血清中cTn-I 水平的影響Fig.4 Effects of Sanyidan on serum cTn-I levels of myocardial ischemic rats

圖5 三益丹對心肌缺血大鼠血清中CK、LDH、AST 水平的影響Fig.5 Effects of Sanyidan on serum levels of CK，LDH，and AST in myocardial ischemic rats

3.4 大鼠血清中CK、LDH、AST 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH、AST 水平升高（P＜0.01）。而給予復方丹參滴丸及不同劑量的三益丹預保護，大鼠血清CK、LDH、AST 水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

3.5 大鼠血清中NO、MDA 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中NO、MDA 水平升高（P＜0.01）。而給予復方丹參滴丸及三益丹中、高劑量進行預保護，大鼠血清NO、MDA 水平下降（P＜0.05）。見圖6。

3.6 大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01）。而給予復方丹參滴丸及不同劑量的三益丹進行預保護，除三益丹低劑量組IL-6 水平差異無統計學意義（P＜0.05）外，各給藥組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖7。

4 討論

圖6 三益丹對心肌缺血大鼠血清NO、MDA 水平的影響Fig.6 Effects of Sanyidan on serum levels of NO，MDA in myocardial ischemic rats

圖7 三益丹對心肌缺血大鼠血清TNF-α、IL-6 水平的影響Fig.7 Effects of Sanyidan on serum levels of TNF-α and IL-6 in myocardial ischemic rats

目前誘導心肌缺血模型的方法有冠脈結扎法、藥物誘導法。其中冠脈結扎法為經典方法，但對動物造成的手術創傷較大、死亡率和成本較高。而藥物誘導法簡單、易行、省時、省力，多用于藥理、藥效學的研究，既可預防給藥亦可治療給藥。藥物誘導劑常用ISO 皮下或腹腔注射，也有少量文獻報道采用垂體后葉素舌下靜脈或腹腔注射［6-7］。ISO為β 受體激動劑，可引起心肌強烈收縮，使心肌細胞耗氧量急劇增加［8］。相關文獻報道，注射ISO的劑量對造模的程度影響較大，60 mg／kg 以下的劑量誘導造成的損傷大部分為可逆性損傷，存在自愈的現象；而85 mg／kg 及以上的劑量誘導造成的損傷多為不可逆損傷，基本可以排除機體自愈對藥理作用機制的影響。其中采用85 mg／kg 誘導心肌缺血動物模型較多，最為成熟。因此，本實驗采用85 mg／（kg／d）的ISO 劑量連續皮下注射3 d 復制心肌缺血動物模型。

心肌缺血臨床表現為，心電圖ST 段抬高，其抬高程度可以反映心肌缺血和心肌損傷的嚴重程度，為心肌缺血損傷程度最直觀的標志之一［9］。cTn 屬于一種心肌收縮的調節蛋白，大量存在于心肌細胞中，包括cTn-T、cTn-I、cTn-C 3 種不同基因的亞基，其中cTn-I 在心肌中有2 種存在形式，大多數以結合形式在肌原纖維中存在，少量以游離形式存在于細胞質中。在心臟受損早期，cTn-I 會以游離形經過淋巴循環進入血液。在心肌細胞受損后期，肌原纖維被不斷破壞，結合形式的cTn-I 會持續釋放，機體中cTn-I 水平會明顯升高，一般在發病14～24 h，cTn-I 水平達高峰，持續時間較長。且cTn-I 指標的敏感性、特異性不易受其他因素的影響，是反映心肌損傷的特異性標志物，當心肌組織出現微小區域壞死時，即可檢測到肌鈣蛋白的升高［10-12］。因此cTn-I 可作為評估心肌缺血或梗死中心肌損傷情況的一個重要指標。CK、LDH、AST是人體3 種重要的心肌酶，正常人血清中心肌酶水平較少，當心肌組織受到損傷時血管通透性增加，細胞內的酶發生外漏，導致血清中心肌酶含量增加，心肌酶含量的多少亦可反映心肌受損和壞死程度，也常用作心肌損傷的診斷標志物［11-15］。當心肌受損時，心肌組織會出現病理改變，心臟病理切片最能直觀的觀察心肌損傷的程度。本實驗通過復制ISO 致大鼠心肌缺血模型，通過觀察心肌缺血大鼠心電圖ST 段、心肌組織病理損傷程度，同時測定cTn-I、CK、LDH、AST 特異性指標水平變化，發現三益丹能有效的降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高程度，減輕心肌組織的病理損傷，明顯降低心肌缺血大鼠血清中cTn-I、CK、LDH、AST 的水平。從而表明三益丹對ISO 致大鼠心肌缺血有預防性保護作用。

MDA 為ROS 與細胞膜上不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的終產物，MDA 的水平可以反應脂質過氧化程度［13］。TNF-α 是一種單核因子，主要由血液單核細胞和組織巨噬細胞產生，是重要的致炎因子，而且可直接誘導心肌細胞凋亡［16］。IL-6主要由活化的中性粒細胞產生，是重要的炎性因子和免疫調節因子［17］。當心肌缺血發生時，可引起TNF-α、IL-6 等炎性因子釋放，促使中性粒細胞向損傷區域聚集，組織浸潤增加，從而引發炎性反應，同時產生大量自由基，加劇組織損傷。有證據表明，當NO 處在高濃度狀態下時，可以誘導促炎細胞因子TNF-α 和IL-6 等的產生和釋放，TNF-α又能進一步激活一氧化氮合酶（iNOS），從而產生更多的NO，形成正反饋循環調節，使炎性細胞因子以及NO 持續表達，致使炎癥反應更持久、更劇烈［18］。心肌缺血損傷其發生機制較為復雜，氧化應激和炎癥反應對心肌缺血的發生具有重要意義［19］。本實驗通過測定心肌缺血大鼠血清中MDA、NO、TNF-α 和IL-6 水平，發現三益丹中高劑量組能顯著降低體內炎癥因子的釋放和脂質過氧化物的含量，表明改善心肌缺血的作用機理可能與抗氧化減少脂質過氧化物、抗炎減少炎性因子釋放等因素有關，從而減輕心肌損傷。

綜上所述，三益丹對ISO 致大鼠心肌缺血有預防性的保護作用，為臨床用于心血瘀阻引起的心前區悶痛不適（心絞痛）提供依據，也證明了其療效的可靠性，為后期的進一步開發應用提供依據。同時證明其作用機理可能與抗氧化、抗炎等因素相關，詳細機理有待進一步研宄。