扶正抑瘤湯對(duì)膠質(zhì)瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制的影響

吳建軍 許 瑞 張艷霞臧凱宏岳 嘉劉 凱劉永琦李應(yīng)東鄭貴森?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000； 2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000； 3.甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000）

腫瘤靶向治療的研究倍受關(guān)注，但在治療膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌等侵襲性和浸潤(rùn)性強(qiáng)的腫瘤時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞高度遷移和侵襲，往往很難對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的藥物靶向治療。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種多能祖細(xì)胞，存在于骨髓、脂肪組織、胎盤(pán)和臍帶等組織中［1］。BMSCs 具有易復(fù)制［1-4］、歸巢［5］、基因易修飾［6］和免疫調(diào)節(jié)作用［7］等生物學(xué)特性，BMSCs 的臨床治療在倫理上不受限制，以上顯示BMSCs 在腫瘤靶向治療中可充當(dāng)傳遞載體而應(yīng)用并潛力巨大［8］。然而，需要關(guān)注的是有些研究表明BMSCs 在腫瘤微環(huán)境下可通過(guò)促進(jìn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，刺激血管生成，抑制免疫細(xì)胞等方式刺激腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［7，9-10］。那么尋找到既能遏制BMSCs 成瘤性又能協(xié)同發(fā)揮其抗腫瘤及靶向載體的作用是目前人們亟待解決的問(wèn)題。

中醫(yī)藥在提高腫瘤患者放化療敏感性，減少腫瘤患者放化療的不良反應(yīng)和并發(fā)癥，提高其生活質(zhì)量和生存時(shí)間等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)［11-12］。研究顯示中醫(yī)藥對(duì)腫瘤微環(huán)境下的BMSCs 進(jìn)行干預(yù)能夠很好維持其遺傳穩(wěn)定性而不發(fā)生改變［13］，扶正抑瘤復(fù)方在前期的抗腫瘤應(yīng)用方面效果顯著［14-16］。另外前期研究也發(fā)現(xiàn)在體外膠質(zhì)瘤微環(huán)境下，扶正抑瘤湯（Fuzheng Yiliu Decoction）能夠有效逆轉(zhuǎn)BMSCs 成瘤性而發(fā)揮其自身的抗瘤作用但自身生物學(xué)特性并不改變［17-18］。所以本研究擬體內(nèi)觀察扶正抑瘤湯能否協(xié)同INF-γ 基因修飾的BMSCs 發(fā)揮靶向抗腫瘤及其可能存在的機(jī)制。

1 材料

1.1 BMSCs 原代及細(xì)胞株 U251 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。BMSCs 原代培養(yǎng)、分離和鑒定，8 周齡Balb／c 小鼠（購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）頸椎脫臼法處死后在無(wú)菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，去除骨骺端，用DMEM溶液沖洗骨髓直至骨髓腔變白，吸入離心管內(nèi)，離心、棄上清后加入DMEM 培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基并沖洗去除未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。一般10 d 細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到70%以上用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記CD44、CD105、CD34、CD45、CD11b鑒定［2-4］。

1.2 藥物與試劑 紅芪（批號(hào)160627）、當(dāng)歸（批號(hào)160713）、莪術(shù)（批號(hào)160525）、墓頭回（批號(hào)160503）中藥飲片購(gòu)自甘肅復(fù)興厚中藥飲片藥業(yè)有限公司，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院相關(guān)教研室鑒定。DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco 公司，HLM150312）；胎牛血清（美國(guó) Gibco 公司，HLC0101）；TRIzol（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，R0016）、熒光定量PCR 試劑、SYBR Green I（重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司自制）；免疫組化Bax／Bcl-2 蛋白一抗、生物素標(biāo)記的二抗（美國(guó)，abcam，ab134047）；IgG-PE（美國(guó)eBioscience 公 司，12-4714-71 ），Rat CD45-PECyanine5.5（美國(guó)eBioscience 公司，35-0459-42）；IgG1-PE-Cyanine5.5（美國(guó)eBioscience 公司，35-0567-41）；其余試劑用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 CK-40 倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；MCO-15AC-SC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋株式會(huì)社）；TCS SP5 激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）。ECLIPSE Ti 熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。T100 型PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）。

2 方法

2.1 BMSCs 的分離、培養(yǎng)和鑒定 Balb／c 小鼠處死后75%乙醇浸泡，無(wú)菌條件下分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS 溶液沖洗后去除骨骺端，DMEM-F12 溶液沖洗骨髓直至骨髓腔變白，1 000 r／min 離心5 min，進(jìn)行系列處理后用含15% 胎牛血清及青鏈霉素的 DMEM-F12 以1×106／mL細(xì)胞濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后棄去培養(yǎng)基（看細(xì)胞貼壁情況），以后每3 天半量換液1次。經(jīng)0.25% 胰酶消化，12 傳代，其后一般3～5 d傳代1 次，選取生長(zhǎng)良好的第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)胰酶消化P4 代BMSCs，用PBS 清洗3 遍，計(jì)數(shù)細(xì)胞，重懸細(xì)胞后送至流式實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2.2 BALB／C 裸鼠造模［19-20］及分組 6～7 周齡裸鼠，15～20 g，雄雌不限，36 只，由北京華阜康生物科技股份有限責(zé)任公司提供。裸鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、空載慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 組（BMSCs組）、負(fù)載INF-γ 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 組（INF-γ ＋BMSCs 組）、扶正抑瘤湯組、扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ 轉(zhuǎn)染BMSCs 注射處理組（扶正抑瘤湯＋ INF-γ ＋BMSCs 組）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度為1×107／mL，每只在裸鼠在腋下皮下接種U251 細(xì)胞150 L。接種后觀察荷瘤裸鼠體質(zhì)量及其他生長(zhǎng)情況，待皮下腫瘤直徑約1 cm 后篩選造模成功裸鼠。在給藥前1 天尾靜脈注射懸于PBS 中空載慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 細(xì)胞1×107／mL，IFN-γ＋BMSCs 組、扶正抑瘤湯＋I(xiàn)FN-γ＋BMSCs 組在給藥前1 天尾靜脈注射懸于PBS 中轉(zhuǎn)染IFN-γ 基因的BMSCs 細(xì)胞1×107／mL，每只裸鼠注射0.2 mL細(xì)胞懸液。扶正抑瘤湯組、扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組用扶正抑瘤湯浸提液灌胃給藥，給藥劑量胃生藥0.6 g／20 g，1 次／d，連續(xù)14 d。干預(yù)結(jié)束后將荷瘤腫瘤組織切片-20 ℃冰凍備用。激光共聚焦檢測(cè)時(shí)取出冰凍切片室溫復(fù)溫30 min 后PBS清洗3 次，5 min／次；DAPI 染核15 min；PBS 清洗3 次，5 min／次。抗熒光淬滅劑，封片后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)瘤體組織熒光分布情況。

2.3 扶正抑瘤湯制備 本研究所用扶正抑瘤湯為甘肅省名老中醫(yī)趙健雄教授研制配方［21］，扶正抑瘤湯由紅芪、當(dāng)歸、莪術(shù)、墓頭回按一定配方組成。其中紅芪、當(dāng)歸、莪術(shù)、墓頭回按3∶1∶1∶3 比例混合，純凈水浸泡以上藥物40 min，每次加水3 L煎煮，共煎煮3 次，將3 次煎煮液合并后濃縮，最終制成含生藥1 g／mL 的浸提液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩７稣至鰷嵋簞┌凑涨捌谠囼?yàn)的有效劑量折算為0.6 g（生藥）／20 g 灌胃干預(yù)。

2.4 表達(dá)INF-γ 慢病毒載體構(gòu)建 從Gene Bank釣取目的基因，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成引物并行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增。將擴(kuò)增目的基因進(jìn)行酶切純化。純化后目的基因與線(xiàn)性化的載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆先進(jìn)行酶切并鑒定。比對(duì)目的基因序列，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的目的基因表達(dá)質(zhì)粒載體。制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助質(zhì)粒（重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技公司），共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h 更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，按照體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)慢病毒滴度的要求，按照密度梯度離心法濃縮其后得到高滴度的慢病毒顆粒，分裝后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)熒光顯微鏡或FACS 計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。按照1×104數(shù)量接種BMSC 細(xì)胞，用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的BMSC 培養(yǎng)基，混勻后孵育過(guò)夜（37 ℃，5%CO2）。10 h 后使用重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司自制熒光染料試劑盒，利用熒光定量PCR 方法驗(yàn)證IFN-γ 轉(zhuǎn)染效果。

2.5 ELISA 檢測(cè)裸鼠血清INF-γ 水平 在酶標(biāo)板孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，經(jīng)過(guò)孵育，樣本中存在的IFN-γ 與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入生物素化的檢測(cè)抗體孵育。洗滌去除未結(jié)合的生物素化的抗體，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。洗滌后，加入顯色底物TMB，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與樣本中的IFN-γ 水平呈正比，在450 nm 波長(zhǎng)（參考波長(zhǎng)570 nm）測(cè)定吸光度值。

2.6 觀察荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)狀況 裸鼠每隔兩天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，腫瘤體積＝ ［長(zhǎng)徑×（短徑×短徑）／2］，裸鼠腫瘤體積增值＝V14d-V1d，并記錄裸鼠體質(zhì)量變化。

2.7 免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取材瘤體組織用PBS 清洗后用4%多聚甲醛固定。制作石蠟切片后經(jīng)脫蠟、復(fù)水、清洗等步驟，具體按照免疫組化相關(guān)步驟進(jìn)行操作。雙染后各組每個(gè)指標(biāo)選腫瘤組織10 個(gè)組織切片，每片選5 個(gè)視野，用BI-2000 圖像分析軟件系統(tǒng)作圖像分析，測(cè)定光密度（IOD）值，取平均值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，服從正態(tài)分布兩組之間用t檢驗(yàn)；多組間用單因素方差分析，兩兩之間比較SNK 檢驗(yàn)；以α＝0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs 原代培養(yǎng)、分離和鑒定 BMSCs 原代培養(yǎng)約24 h 后即可出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形為主的多種形態(tài)（圖1）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞表型高表達(dá)CD44（98.01%）和CD105（96.17%），不表達(dá)CD34（1.46%）、CD45（1.32%）、CD11b（1.48%）。細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面免疫標(biāo)志物表達(dá)與前期我們研究和文獻(xiàn)報(bào)道相符，可以判定為BMSCs［2-4，22］。

圖1 原代培養(yǎng)第7 天和傳代以后的BMSCsFig.1 BMSCs on day 7 and after passage

3.2 BMSCs 細(xì)胞INF-γ 轉(zhuǎn)染的驗(yàn)證 INF-γ 基因轉(zhuǎn)染后，BMSCs 組INF-γmRNA 表達(dá)低于INF-γ＋BMSCs 組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染后BMSCs 細(xì)胞中INF-γ mRNA 表達(dá)（，n＝3）Tab.1 Expression of INF-γ mRNA in BMSCs cells after transfection（， n＝3）

表1 轉(zhuǎn)染后BMSCs 細(xì)胞中INF-γ mRNA 表達(dá)（，n＝3）Tab.1 Expression of INF-γ mRNA in BMSCs cells after transfection（， n＝3）

注：與BMSCs 組比較，?P＜0.05。

3.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)BMSCs 在裸鼠瘤體組織中分布 在激光共聚焦顯微鏡下，模型組、扶正抑瘤湯組瘤體組織未見(jiàn)熒光，而B(niǎo)MSCs 組、INFγ＋BMSCs 組和扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組裸鼠瘤體組織中可見(jiàn)熒光，顯示BMSCs 歸巢作用特性，在瘤體組織集聚分布，見(jiàn)圖2。

3.4 血清中INF-γ 水平 與模型組比較，INF-γ＋BMSCs 組、扶正抑瘤湯組、扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組INF-γ 水平增加（P＜0.05）；與BMSCs組比較，INF-γ＋BMSCs 組、扶正抑瘤湯組、扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組INF-γ 水平也增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。

3.5 荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)狀況 灌胃給藥14 d 后，與模型組比較，扶正抑瘤湯組和扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NFγ＋BMSCs 組裸鼠腫瘤體積增值減少（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖2 激光共聚焦檢測(cè)各組BMSCs 在裸鼠瘤體組織中熒光分布（×400）Fig.2 Fluorescence distribution of BMSCs in nude mice by Laser confocal observation（×400）

表2 各組血清中INF-γ 的水平（， n＝8）Tab.2 Levels of INF-γ in serum of each group（， n＝8）

表2 各組血清中INF-γ 的水平（， n＝8）Tab.2 Levels of INF-γ in serum of each group（， n＝8）

注：與模型組比較，?P＜0.05；與BMSCs 組比較，＃P＜0.05。

3.6 各組裸鼠瘤體組織凋亡蛋白Bax／Bcl-2 表達(dá)Bax／Bcl-2 陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞漿，呈清晰彌漫性分布，部分陽(yáng)性細(xì)胞也可在胞質(zhì)或核膜上（圖3～4）。干預(yù)后，與模型組和BMSCs 組比較，INF-γ＋BMSCs 組、扶正抑瘤湯組和扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組Bax 表達(dá)升高（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)下降（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 各組裸鼠治療14 d 后腫瘤體積的增值（mm3，，n＝8）Tab.3 Tumor volume increase of nude mice in each group after 14-day treatment（mm3，， n＝8）

表3 各組裸鼠治療14 d 后腫瘤體積的增值（mm3，，n＝8）Tab.3 Tumor volume increase of nude mice in each group after 14-day treatment（mm3，， n＝8）

注：與模型組比較，?P＜0.05。

圖3 各組裸鼠瘤體組織凋亡蛋白Bax 表達(dá)（×400）Fig.3 Bax expression of apoptotic protein in tumor tissue of nude mice in each group（×400）

圖4 各組裸鼠瘤體組織凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)（×400）Fig.4 Bcl-2 expression of apoptotic protein in tumor tissue of nude mice in each group（×400）

表4 各組裸鼠瘤體組織凋亡蛋白Bax／Bcl-2 表達(dá)（%，， n＝8）Tab.4 Bax／Bcl-2 expression in tumor tissue of nude mice in each group（%，， n＝8）

表4 各組裸鼠瘤體組織凋亡蛋白Bax／Bcl-2 表達(dá)（%，， n＝8）Tab.4 Bax／Bcl-2 expression in tumor tissue of nude mice in each group（%，， n＝8）

注：與模型組比較，?P＜0.05；與BMSCs 組比較，＃P＜0.05。

4 討論

膠質(zhì)瘤侵襲性和浸潤(rùn)性較強(qiáng)，藥物靶向治療效果有限，研究還發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤的免疫耐受微環(huán)境從而進(jìn)一步增加其治療難度［23］，所以新的靶向治療應(yīng)用研究越來(lái)越受到期待［24］。BMSCs 被越來(lái)越多用于治療膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究［17-18，24-26］，雖然BMSCs 相關(guān)研究在膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展，由于各種原因目前還沒(méi)有基于BMSCs 的惡性膠質(zhì)瘤治療的臨床試驗(yàn)。

以細(xì)胞為基礎(chǔ)的靶向抗腫瘤療法必須依賴(lài)BMSCs 主動(dòng)定位到腫瘤組織的能力，以及它們影響靶點(diǎn)細(xì)胞的內(nèi)在能力，但BMSCs 作為生物治療的首選載體其安全性仍然不清楚［8］。研究顯示BMSCs具有類(lèi)似于癌細(xì)胞的自我更新能力，以及在體外自發(fā)轉(zhuǎn)化的能力，曾經(jīng)有人提出腫瘤可能是由侵襲性極強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)［27］。但隨后日本科學(xué)家證實(shí)BMSCs 和癌細(xì)胞在增殖基因表達(dá)實(shí)際上仍存在顯著差異［28］。BMSCs 由于其本身不確定性及可能存在的成瘤性導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用研究中被限制，但BMSCs 作為攜帶外源性基因載體被廣泛應(yīng)用在治療腫瘤的基礎(chǔ)研究中［7，27，30］。本研究通過(guò)PCR 檢測(cè)到BMSCs 能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染INF-γ 基因，且通過(guò)激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)BMSCs 在腫瘤組織具有較好的歸巢作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了BMSCs 作為腫瘤生物治療載體可靠性。

傳統(tǒng)手術(shù)、放化療聯(lián)合中醫(yī)藥臨床治療腫瘤正顯示其巨大優(yōu)勢(shì)［13］，“扶正”和“驅(qū)邪”治法是中醫(yī)治療腫瘤的主要方法［31-34］。“扶正”治法能升高T 細(xì)胞免疫缺陷裸鼠體內(nèi)NK 細(xì)胞水平，增強(qiáng)NK 細(xì)胞FasL 表達(dá)而抑制腫瘤發(fā)展［32］。前期研究發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯含藥血清可在體外通過(guò)抑制BMSCs 的端粒酶活性、增加p53 的表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式而很好逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤微環(huán)境下的BMSCs成瘤性［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯能夠與INF-γ基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 發(fā)揮較好的協(xié)同靶向治療作用，進(jìn)一步提示中醫(yī)藥可以在BMSCs 靶向載體治療中發(fā)揮很好的“減毒增效”作用。

由于裸鼠T 細(xì)胞免疫缺陷，裸鼠在腫瘤移植后與臨床病患環(huán)境非常接近［35］。6～8 周齡裸鼠比較普通鼠有較高水平的非特異性免疫功能，其自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）及巨噬細(xì)胞免疫活性也較強(qiáng)［36］。本研究應(yīng)用裸鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察血清過(guò)表達(dá)IFN-γ能否促使誘導(dǎo)NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被募集到腫瘤部位發(fā)揮巨大的抗腫瘤作用［30，37-38］。本研究結(jié)果表明扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組血清IFN-γ 比其它各組明顯升高（P＜0.05），而且比單純扶正抑瘤湯組要高，結(jié)合抑制腫瘤生長(zhǎng)的結(jié)果，可能存在扶正抑瘤湯＋I(xiàn)NF-γ＋BMSCs 組通過(guò)表達(dá)INF-γ 誘發(fā)非特異性免疫功能并且與扶正抑瘤湯協(xié)同而發(fā)揮抗腫瘤作用。

當(dāng)然，本研究尚缺乏細(xì)胞因子INF-γ 對(duì)抗原提呈細(xì)胞（NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）激活等影響的直接證據(jù)，而扶正抑瘤湯是否促進(jìn)荷瘤裸鼠非特異性免疫功能而發(fā)揮“扶正”作用尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。