加熱時間對余甘子水煎液中沒食子酸的影響

吳佳欣 周 波鄧萌萌陳 敏 潘曉鵑?

（1.西南醫科大學藥學院，四川 瀘州646000； 2.四川省中醫藥科學院，四川成都610041； 3.重慶市中藥研究院，重慶404100）

余甘子收載于2015 年版《中國藥典》一部，性甘、酸、澀，涼，具有清熱涼血，消食健胃、生津止咳的功效［1］。其為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實［2］，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區，在我國主要分布于云南、四川、福建、廣西等地。余甘子主要活性成分為鞣質、黃酮、維生素C 和多糖等［2］，藥理研究表明，其具有抗氧化［3-5］、抗菌［6-8］、抗炎［9-11］、抗誘變［12］、抗腫瘤［12-16］、增強免疫力［16-18］、降血糖［19-22］等作用，已成為聯合國衛生組織在全世界推廣種植的保健植物［23］，在我國將其作為藥食兩用植物。

實驗發現余甘子水提物中沒食子酸轉移率超過100%，可高達300%，若干次實驗驗證了這個結果并非實驗誤差造成。為保障藥物有效性、安全性，對余甘子水煎工藝過程進行探索性研究具有重要意義。本研究以余甘子藥材為原料，設定不同時間進行水煎實驗，采用HPLC 法測定各水煎液的沒食子酸含有量并對其成分進行對比分析，以期弄清成分變化的原因及規律。

1 材料

1260 系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；3K15 型高速冷凍離心機（美國Sigma 公司）；MS 205 DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Integral-3 型純水／超純水一體化系統（成都寶賽思科技有限公司）。沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201605，純度90.8%）；單寧酸、柯里拉京、鞣花酸對照品（成都德思特生物技術有限公司，批號分別為1401-55-4，23094-69-1，476-66-4，純度≥98%）。

余甘子藥材（云南，批號20171121）購于成都荷花池中藥材市場，按2015 年版《中國藥典》（一部）余甘子項下含有量測定得沒食子酸含有量1.62%，經四川省中醫藥科學院中藥資源與種植研究所方清茂研究員鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實；實驗用水為超純水，HPLC 用甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 水煎樣品制備 取余甘子藥材粗粉11 份，每份40 g，分別置于圓底燒瓶內，加水400 mL，稱定質量，分別于100 ℃水浴回流1、2、3、4、8、12、24、36、48、72、96 h，回流結束后于冰浴中迅速冷卻，補足減失質量，于5 000 r／min 離心10 min，取上清液即可，獲得不同煎煮時間樣品，備用。

2.2 色譜條件 Ultimate AQ -C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1% 甲酸水溶液，梯度洗脫（0～3 min，0%A；3～10 min，0%～3%A；10～15 min，3%～5%A；15～25 min，5%～15%A；25～30 min，15%～16%A；30～55 min，15%～60% A；55～70 min，60%～90% A）；體積流量1.2 mL／min；柱溫15 ℃；檢測波長273 nm；進樣量10 μL。理論塔板數以沒食子酸計算不低于4 500，沒食子酸色譜峰與相鄰峰的分離度大于1.5，峰形對稱，色譜圖見圖1。

2.3 對照品溶液制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，于25 mL 量瓶中，加50% 甲醇溶解并定容，得到沒食子酸質量濃度為0.361 5 g／L 的對照品溶液，作為貯備液。

2.4 供試品溶液制備 精密量取“2.1”項下樣品液各0.5 mL，分別置于蒸發皿中，水浴蒸干，加50%甲醇溶解并轉移至100 mL 量瓶中，定容，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.3”項下對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋定容，搖勻，得系列沒食子酸對照品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，在“2.2”項色譜條件下進樣。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得沒食子酸的回歸方程為Y＝4 232.8X-7.817 7（r＝0.999 9），表明沒食子酸在0.015 8～0.284 9 g／L 范圍內線性關系良好。

圖1 沒食子酸HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of gallic acid

2.6 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣6 次，沒食子酸峰面積RSD 為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取余甘子藥材粗粉6 份，按“2.1”項下方法制備6 份水煎1 h 的樣品，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，記錄峰面積并計算沒食子酸含有量。得水煎1 h 樣品中沒食子酸的平均含有量為1.41 g／L，RSD 為1.68%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h（于5 ℃放置）進樣，記錄峰面積。結果沒食子酸RSD 為1.31%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密量取“2.1”項下水煎1 h 樣品液0.1 mL，共9 份，隨機等分成3 組，按低、中、高質量濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1，分別精密加入沒食子酸對照品溶液，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，記錄峰面積并計算回收率。結果沒食子酸的平均回收率為100.18%，RSD 為1.54%。

2.10 沒食子酸含有量及增量百分比 取“2.4”項下各供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，記錄峰面積并計算沒食子酸含有量（g／L），分別以水煎2～96 h 樣品的沒食子酸的含有量增量與水煎1 h 樣品的沒食子酸含有量比較，得出各樣品沒食子酸含有量的增量百分比。計算公式為沒食子酸含有量的增量百分比＝（A-水煎1 h 水煎液中沒食子酸含有量）／水煎1 h 水煎液中沒食子酸含有量×100%，A為非水煎1 h 樣品的任一樣品中沒食子酸含有量，結果見表1。

表1 不同水煎時間樣品中沒食子酸含有量及增量百分比Tab.1 Gallic acid content and percentage increase of aqueous decoction at different water-decoction time

結果表明，與水煎1 h 相比，水煎2、4、8、12、96 h 沒食子酸含有量增量百分比分別達到60.6%、117.2%、131.0%、334.0%、489.1%。可見，水煎提取至2 h，沒食子酸含有量成倍增加，且含有量隨煎煮時間的延長呈遞增趨勢。

2.11 成分分析

2.11.1 對照品溶液制備

2.11.1.1 沒食子酸對照品溶液制備 精密吸取“2.3”項下對照品溶液3.0 mL，于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇定容，得到沒食子酸質量濃度為0.108 4 g／L 的對照品溶液。

2.11.1.2 單寧酸、柯里拉京、鞣花酸對照品溶液制備 分別取單寧酸、柯里拉京、鞣花酸對照品適量，精密稱定，各自加50%甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得到單寧酸質量濃度為0.103 1 g／L、柯里拉京質量濃度為0.0 927 g／L 和鞣花酸質量濃度為0.1 015 g／L 的對照品溶液。

2.11.2 供試品溶液制備 取“2.1”項下樣品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，得水煎1、2、3、4、8、12、24、36、48、72、96 h 的供試品溶液。

2.11.3 已知成分定性 在“2.2”項色譜條件下，每個對照品溶液單獨進樣，分別獲得沒食子酸、單寧酸、柯里拉京、鞣花酸的保留時間。

取水煎1 h 樣品制備的供試品進樣，色譜峰編號以出峰先后順序依次編為1～19。采用對照品保留時間對組分進行定性，確定色譜峰6 為沒食子酸，色譜峰14 為單寧酸，色譜峰17 為柯里拉京，色譜峰18 為鞣花酸，其他為未知成分。

2.11.4 不同水煎時間樣品色譜圖 在“2.2”項色譜條件下，取“2.11.2”項下供試品溶液進樣，色譜峰的編號以1 h 水煎樣品的供試品出峰先后順序1～19 為基礎，新檢測出的色譜峰編號為20，不同水煎樣品色譜圖見圖2。

圖2 不同水煎時間各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of various constituents at different frying time

煎煮1～96 h，色譜峰6 及未知色譜峰8、11的峰面積隨時間延長逐漸增加，水煎至3 h 時首次檢出未知色譜峰20 且峰面積隨時間延長而逐漸增加。水煎1～96 h，色譜峰14、17、18 和未知色譜峰1、2、3、4、7、9、10、12、13、15、16 的峰面積呈減少趨勢，其中，色譜峰14、18 和未知色譜峰1、2、3、4、7、10、12、13 的峰面積在水煎至4、12 h 時略有增加，隨后逐漸減少，至48 h 時色譜峰14、18 和未知色譜峰12、13 未檢出，未知色譜峰9、15 的峰面積在4 h 時有增加隨后逐漸減少，至8 h 時未知色譜峰9 未檢出，色譜峰17 的峰面積在2、4、24 h 有增加隨后減少，至36 h 時未檢出，未知色譜峰16 的峰面積在4、12、36 h有增加隨后減少。水煎過程中，色譜峰5 的峰面積逐漸減少至12 h 時未檢出。未知色譜峰19 的峰面積幾乎無變化。總之，余甘子水煎96 h 內，3 種成分的量增加，1 種成分新檢出，15 種成分的量減少，其中7 種成分減少至未檢出，1 種成分的量幾乎無變化。

2.12 酶水解實驗 酶水解樣品制備，取余甘子藥材粗粉3 份，每份40 g，分別置于圓底燒瓶內，加水400 mL，加入單寧酶，調節溶液pH 為5.0，稱定質量，分別于35 ℃水浴回流1、4、8 h，酶解結束后先高溫滅酶后于冰浴中迅速冷卻，補足減失質量，于5 000 r／min 離心10 min，取上清液即可，獲得不同酶水解時間樣品。

按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，色譜峰的編號以1 h 水煎樣品的供試品出峰先后順序1～19 為基礎，新檢測出的色譜峰編號為20，記錄峰面積并計算沒食子酸含有量，不同酶水解時間樣品色譜圖見圖3。

圖3 不同酶水解時間各成分HPLC 色譜Fig.3 HPLC chromatogram of various constituents at different enzyme hydrolysis time

與水煎1 h 樣品相比，酶水解1、4、8 h 樣品中沒食子酸含有量分別為3.82、5.25、6.70 g／L，增量百分比分別為173.0%、275.0%、378.0%。酶水解過程中，色譜峰6 的峰面積急劇增加，未知色譜峰8、11 的峰面積逐漸增加。酶水解至8 h 時新檢出未知色譜峰20。色譜峰14、17 和未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、12、13、15、16 的峰面積逐漸減少，其中，色譜峰14 和未知色譜峰4、7、9 在酶水解至1 h 時未檢出，未知色譜峰13、15 在酶水解至4 h 時未檢出，色譜峰17 在酶水解至8 h 時未檢出。色譜峰18 和未知色譜峰19的峰面積幾乎沒變化。可見，酶水解可以加快沒食子酸的生成速率，加快多個色譜峰峰面積的減少速率，且快速使單寧酸、未知色譜峰4、7、9 在酶解1 h 時處于未檢出狀態。

2.13 酸水解 酸水解樣品制備，取余甘子藥材粗粉4 份，每份40 g，分別置于圓底燒瓶內，加2 mol／L HCl 400 mL，稱定質量，分別于100 ℃水浴回流1、2、4、8 h，回流結束后于冰浴中迅速冷卻，補足減失質重，于5 000 r／min 離心10 min，取上清液即可，獲得不同酸水解時間樣品。

按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，色譜峰的編號以1 h 水煎樣品供試品出峰先后順序1～19 為基礎，新檢測出的色譜峰按其先后出峰順序編號為20、21，記錄峰面積并計算沒食子酸含有量，不同酸水解時間樣品色譜圖見圖4。

圖4 不同酸水解時間各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of various constituents at different acid hydrolysis time

與水煎1 h 時樣品相比，酸水解1、2、4、8 h樣品中沒食子酸含有量依次為7.12、8.65、10.27、11.08 g／L，增量百分比分別為408.0%、518.0%、633.0%、691.0%。酸水解1～8 h，色譜峰6 和未知色譜峰8 的峰面積急劇增加，酸水解1 h樣品中新檢出未知色譜峰20 和21，且隨時間延長峰面積緩慢增加，色譜峰14、17 和未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、11、12、13、15、16的峰面積逐漸減少，其中，色譜峰14、17 和未知色譜峰5、9、11、12、13、16 在酸水解至1 h 時未檢出，未知色譜峰3、15 在酸水解至2 h 時未檢出，未知色譜峰4、7 在酸水解至4 h 時未檢出。色譜峰18 和未知色譜峰19 的峰面積幾乎無變化。可見，酸水解可加快沒食子酸的生成速率，新增未知色譜峰20、21，快速增加未知色譜峰8 的峰面積，加快多個色譜峰面積的減少速率，快速使單寧酸、柯里拉京、未知色譜峰5、9、11、12、13、16 在酸水解1 h 時處于未檢出狀態。

2.14 水煎驗證試驗 為排除藥材產地、批次誤差問題，采用云南普洱（沒食子酸含有量1.31%）、四川（沒食子酸含有量1.43%）、江西（沒食子酸含有量2.45%）產地的余甘子進行水煎及成分分析重復試驗。按“2.1”項下方法制備各產地水煎液，在“2.2”項色譜條件下進樣，3 個產地水煎液沒食子酸含有量變化結果見表2，色譜圖見圖5～7。

表2 不同產地樣品水煎液中沒食子酸含有量及增量百分比Tab.2 Gallic acid content and percentage increase in aqueous decoction samples from different growing areas

圖5 云南產地水煎樣品中各成分HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of various constituents of aqueous decoction from Yunnan growing areas

水煎1～96 h，3 個產地的余甘子水煎液中，隨著煎煮時間延長，沒食子酸含有量均顯著增加且呈遞增趨勢，未知色譜峰8、11 的峰面積均逐漸增加，煎煮至4 h 后均檢出未知色譜峰20 且隨煎煮時間延長峰面積逐漸增加，色譜峰14、17、18 和未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、12、13、15、16的峰面積呈減少趨勢，其中，色譜峰14、17、18和未知色譜峰5、9、12、13、16 最后均未檢出。3個產地的余甘子水煎實驗結果與“2.1”項下云南產地余甘子的實驗結果基本一致。可見，不同產地余甘子水煎過程中均發生相同的成分變化趨勢，

圖6 四川產地水煎樣品中各成分HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of various constituents of aqueous decoction from Sichuan growing areas

3 討論

3.1 色譜條件選擇 考察了Sepax Bio-C18、Agilent ZORAX SB-Phenyl、Pheomenex Desi C18、Ultimate Phenyl-Ether、Ultimate AQ-C18等色譜柱，最終選擇Ultimate AQ -C18柱，其分離出的色譜峰多、分離效果好；考察了甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸水、甲醇-0.1% 甲酸水、乙腈∶甲醇（4∶1）-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流動相系統，結果以甲醇-0.1% 甲酸水體系分離效果好。

圖7 江西產地水煎樣品中各成分HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of various constituents of aqueous decoction from Jiangxi growing areas

3.2 水煎與酶水解、酸水解實驗 在水煎、酶水解、酸水解過程中，沒食子酸含有量均隨時間延長而顯著增加，水煎8、96 h 時沒食子酸增量百分比高達131.0%、489.1%，酶水解8 h 時沒食子酸增量百分比高達378.0%，酸水解8 h 時沒食子酸的增量百分比高達691.0%，酶水解、酸水解均加快沒食子酸含有量增加速率。

由于水煎、酶水解、酸水解會快速使某些成分發生變化，因此，在進行水煎、酶水解與酸水解樣品的色譜分析過程中，均采用水煎1 h 樣品作為對照樣品，以反映成分變化情況。水煎、酶水解、酸水解過程中一致的變化規律有沒食子酸和未知色譜峰8 的峰面積逐漸增加，新檢出未知色譜峰20，單寧酸、柯里拉京以及未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、12、13、15、16 的峰面積呈減少趨勢，未知色譜峰19 的峰面積幾乎無變化。可見，余甘子在水煎、酶水解、酸水解過程中，沒食子酸含有量及其他成分變化趨勢基本一致，但變化速率不同，按從快到慢順序依次為酸水解快于酶水解快于水煎。

3.3 原因分析 余甘子主要含多酚酸類成分（包括糅質等），其中可水解鞣質能夠受酸、堿、鞣酶的催化而水解［24-25］。水煎過程中，因多酚酸類成分使水煎液處于酸性狀態，加上持續加熱，發生了水解反應而生成沒食子酸。從水煎、酶水解、酸水解實驗看出，隨著時間增加，沒食子酸含有量顯著增加，柯里拉京、單寧酸和12 種未知成分逐漸減少乃至最終未檢測。柯里拉京、單寧酸的明顯減少可推測其發生了水解反應并釋放出沒食子酸。從沒食子酸量增加較多推測可能另有其他未知成分水解產生了沒食子酸，從而導致沒食子酸含有量顯著增加。此外，水煎、酶水解、酸水解具有較為一致的成分變化趨勢，故推斷余甘子水煎過程發生了水解反應，沒食子酸含有量的增加源于水解反應新產生了沒食子酸，同時伴隨其他成分的改變。

余甘子屬于藥食兩用植物，廣泛應用于藥物、保健品中，水煎是常規提取方法，因此，加熱時間長短會影響余甘子提取物中成分組成及成分含有量，沒食子酸增加及其他成分的增加與減少甚至消失，對其安全性、有效性有什么影響是一個有待解決的問題，因此，應進一步對余甘子的水煎工藝與提取物的成分組成、安全性、有效性進行研究。