超聲輔助雙水相提取山藥皮總多酚工藝的優化

邵圣娟胡學豪郭佳儀常西亮

（太原工業學院化學與化工系，山西 太原030008）

山藥又名薯蕷、懷山藥，作為藥食兩用的中藥材具有助消化、健脾胃、止泄痢、補中益氣之功效，其肉質含有豐富的淀粉、多糖、蛋白質、黃酮、尿囊素、皂苷等多種營養成分［1］，而作為天然抗氧化劑的多酚類物質大多分布于山藥皮中，表現為帶皮山藥抗氧化性優于去皮山藥［2］。每年都會產生大量的山藥皮廢棄物，導致巨大資源浪費，故對其合理利用需引起重視。

目前，植物多酚類物質提取方法有水浴提取［3］、閃式提取［4］、超聲輔助提取［5］、超高壓提取等［6］，常用分離方法包括膜分離［7］、離子沉淀［8］、層析法［9］、雙水相萃取［10］等，其中超聲輔助提取存在超聲物理效應，具有提取時間短、能耗低、提取率高等優點［11］；雙水相萃取是由水溶性聚合物-鹽、離子液體-鹽、低級醇-鹽等組成的互不相容的兩水相體系，依靠溶質組分在兩相間的分配系數差異實現分離的萃取技術［12］，其中低級醇-鹽體系采用水溶性低級醇，與傳統聚合物-鹽體系相比溶劑沸點低，體系黏度、界面張力小，相際間傳質速率快，同時避免了反萃取過程，具有提取率高、溶劑易回收、成本低、操作簡便等優點，廣泛應用于中藥活性成分（如黃酮、多酚、色素、生物堿等）分離［13-17］，常用親水性小分子醇有乙醇、正丙醇、異丙醇，無機鹽有 K2HPO4、Na2HPO4、K2CO3等［18］。

張艷霞等［19］采用超聲輔助雙水相法提取石榴皮多酚，并通過響應面分析研究各因素及其交互作用對該成分得率的影響，經驗證最佳條件下其值為10.63%，表明提取方法可行。因此，本實驗采用超聲波輔助雙水相法提取山藥皮總多酚，并通過響應面法優化提取工藝，以期為該資源開發利用提供依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 山藥皮由太原工業學院餐廳提供，烘干粉碎后過60 目篩，干燥保存備用。硫酸銨、無水碳酸鈉、無水乙醇、福林酚試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 儀器 XH-2008DE 超聲波萃取儀（北京祥鵠科技發展有限公司）；RE-52B 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；TY-800 中藥多功能粉碎機（永康市敏業工貿有限公司）；DHG-9101 干燥箱（金壇市榮華儀器制造有限公司）；723N 可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 總多酚含有量測定

2.1.1 線性關系考察［19］采用福林酚法測定總多酚含有量。吸取1.50 g／L 沒食子酸對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，蒸餾水分別稀釋成0、75、150、225、300、375 mg／L，分別移取1 mL 至10 mL 量瓶中，加入0.1 mol／mL福林酚試劑1 mL，搖勻，靜置5 min，再加入7.5% Na2CO3溶液5 mL，蒸餾水定容至刻度，室溫下避光放置2 h，以空白試劑為對照，在765 nm 波長處測定吸光度。以吸光度（A）對沒食子酸質量濃度（X）進行回歸，得方程為A＝0.017 2X＋0.019 8（R2＝0.998），在0～45.000 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.1.2 測定步驟 稱取2.0 g 山藥皮干粉于三口燒瓶中，加入一定比例乙醇-硫酸銨雙水相體系，在適宜條件下進行超聲輔助提取，粗提液真空抽濾，濾液靜置分層后取上清液，按“2.1.1”項下方法測定吸光度，計算總多酚含有量，進而求出得率Y，公式為Y＝，其中c為總多酚含有量，V為上層提取液總體積，n為稀釋倍數（10 倍），m為山藥皮干粉質量。

2.2 超聲輔助雙水相提取工藝

2.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系建立 常溫下配制一定質量濃度硫酸銨溶液，采用濁點滴定法［20］逐滴加入無水乙醇，使體系呈現渾濁，記錄此時乙醇體積及體系總體積，再滴加去離子水使其轉澄清，記錄此時體系總體積，然后繼續滴加無水乙醇至再次發生渾濁，反復上述操作，計算各個濁點下乙醇體積分數和硫酸銨質量濃度。以溶液質量濃度為縱坐標，乙醇體積分數為橫坐標繪制雙水相體系相圖，以此確定其穩定的范圍。

2.2.2 單因素試驗 稱取2 g 山藥皮干粉于三口燒瓶中，加入雙水相體系（乙醇體積分數20%～60%，硫酸銨質量濃度0.1～0.3 g／mL），液料比20∶1～40∶1，設定儲液槽溫度40 ℃，超聲功率400～800 W，超聲時間10～50 min，進行超聲輔助提取。將所得粗提液按“2.1”項下方法操作，考察乙醇體積分數、硫酸銨質量濃度、液料比、超聲功率、超聲時間對總多酚得率的影響。

2.2.3 響應面分析 收集上清液，蒸發濃縮，由于硫酸銨不溶于甲醇，故將其濃縮結晶物溶于甲醇中抽濾，濾液蒸發濃縮干燥，即得總多酚提取物。基于單因素試驗結果，選擇硫酸銨質量分數（A）、液料比（B）、超聲功率（C）作為影響因素，設計三因素三水平試驗，結合響應面分析確定最優提取工藝，因素水平見表1。

表1 因素水平

3 結果

3.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖 見圖1。其中，ABC 曲線為雙水相體系的雙節線，曲線下方為單相區，曲線為成相臨界點，上方為兩相區；AC 為系線，線上各點成相相比服從杠桿規則，由此可認為當硫酸銨質量濃度為0.3 g／mL 時，乙醇體積分數為25%～50%，可與其形成穩定的雙水相體系，與文獻［21］報道基本一致。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖

3.2 單因素試驗

3.2.1 雙水相體系組成 固定硫酸銨質量濃度為0.3 g／mL，考察與其成穩定雙水相的乙醇體積分數30%、40%、50%對總多酚得率的影響，結果見圖2A。由此可知，當乙醇體積分數為30% 時，總多酚得率較低，僅為1.5 mg／g；隨著其體積分數升高，可與硫酸銨形成良好的雙水相體系，而且上相體積加大時得率升高，在40%、50%時接近3.8 mg／g，同時后者略有下降。考慮到溶劑消耗量和提取率，確定乙醇體積分數為40%。

固定乙醇體積分數為40% 時，考察硫酸銨質量濃度0.15～0.35 g／mL 對總多酚得率的影響，結果見圖2B。由此可知，當硫酸銨質量濃度為0.15 g／mL 時，雙水相分相不明顯，體系不穩定；隨著其質量濃度升高，可逐漸形成穩定的雙水相體系，從而增加總多酚得率，在0.25 g／mL時最高；但其質量濃度繼續升高時得率反而下降，其原因是隨著硫酸銨用量增加，下相水合能力加強而體積加大，同時上相體積減小，所含乙醇相對體積分數、對總多酚的分配系數增大，提取率升高［22］，但當其用量繼續升高時，雙水相體系極性增大，使多酚及水溶性雜質主要存在于下相，導致得率降低，而且靜置分層時易出現冷卻結晶現象。因此，確定硫酸銨質量濃度為0.20～0.30 g／mL。

圖2 硫酸銨質量濃度（A）、乙醇體積分數（B）對總多酚得率的影響

3.2.2 提取條件 圖3A 顯示，總多酚得率隨著液料比增加而升高，其原因是隨著溶劑用量增大，溶劑對有效組分的溶解能力加強，且液固間濃度差越大，傳質速率越快，有利于多酚向溶劑中擴散；當液料比大于25∶1 時，得率增速變緩，在4 mg／g 左右，并且此時山藥皮中大量雜質也會相繼溶出，不利于多酚純化。考慮到經濟性，確定液料比范圍為20∶1～30∶1。

圖3 液料比（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）對總多酚得率的影響

圖3B 顯示，總多酚得率隨超聲功率升高呈現先增大后減小的趨勢，在600 W 時最高，主要是因為超聲功率較低時超聲波對于細胞壁的破壞作用較小，溶劑穿透力差，并且溶質分子熱運動慢，從而降低了多酚浸出率；隨著其逐漸增大，分子熱運動逐漸加劇，從而提高了提取率；超過600 W 時，可能會引起多酚分解［23］，導致提取率降低。因此，確定超聲功率范圍為500～700 W。

圖3C 顯示，在一定范圍內總多酚得率隨著超聲時間延長基本變化不大；超過40 min 后得率略有下降，但基本維持在3.8 mg／g，可能與控溫條件下存在超聲波衰減形成超聲空白有關［24］。在不同超聲時間作用下，各粗提液上相體積無明顯變化，質量濃度相近，總多酚得率穩定，可見超聲時間對其影響較小，故確定超聲時間為20 min。

3.3 響應面分析 固定乙醇體積分數40%、超聲時間20 min，以硫酸銨質量濃度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）為影響因素，總多酚得率（Y）為評價指標進行試驗，結果見表2。

表2 試驗設計與結果

通過Design-Expert 8.0.5b 軟件對表2 數據進行多元回歸分析，得方程為Y＝3.98＋0.17A＋0.39B＋0.037C＋0.037AC-0.042BC-0.21A2-0.33B2-0.25C2，方差見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，而失擬項P＞0.05，表明模型合理；相關系數R2＝0.997＞0.9，＝0.993，表明模型擬合度良好；＝0.98，表明模型預測性良好；因素A、B、C、A2、B2、C2、BC、AC影響明顯（P＜0.05），各因素影響程度依次為液料比（B）＞硫酸銨質量濃度（A）＞超聲功率（C）。

根據方差分析結果進行響應面分析［25］，結果見圖4。最優工藝為乙醇體積分數40%，硫酸銨質量濃度0.27 g／mL，液料比28.01∶1，超聲功率605.68 W，超聲時間20 min，總多酚得率為4.136 mg／g，根據實際情況將其修正為乙醇體積分數40%，硫酸銨質量濃度0.27 g／mL，液料比28∶1，超聲功率605 W，超聲時間20 min。在此條件下進行3 批驗證試驗，測得總多酚得率分別為4.14、4.12、4.18 mg／g，平均4.147 mg／g（RSD＝0.74%），與預測值4.136 mg／g 偏差率為0.26%，表明模型預測性良好。將粗提液濃縮，結晶物溶于甲醇后抽濾，蒸發濃縮干燥，測得總多酚提取物質量分數可達57%。

表3 方差分析

圖4 各因素響應面圖

4 結論

本實驗采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取山藥皮總多酚，再采用單因素試驗考察各因素對其得率的影響趨勢，確定雙水相體系乙醇體積分數為40%，超聲時間為20 min。在此基礎上，通過響應面法發現各因素影響程度依次為液料比＞硫酸銨質量濃度＞超聲功率，最優工藝為乙醇體積分數40%，硫酸銨質量濃度0.27 g／mL，液料比28∶1，超聲功率605 W，超聲時間20 min，總多酚得率為4.147 mg／g，質量分數為57%，與超高壓輔助提取所得結果相當［24］。綜上所述，該方法采用低級醇-鹽雙水相體系提取，有機溶劑用量少，提取時間短，能耗低，產品質量分數較高，可有效用于山藥皮總多酚的提取純化。