鞣花酸對糖尿病小鼠胰腺炎的改善作用

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（1.新疆醫科大學藥學院藥理教研室，新疆 烏魯木齊830011； 2.新疆醫科大學第一附屬醫院省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊830011； 3.烏魯木齊軍區總醫院，新疆 烏魯木齊830011）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代謝紊亂為特征的慢性炎癥性疾病，胰腺的炎癥在糖尿病的發生發展中扮有重要角色［1］。研究［2-4］顯示，硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）介導內質網應激，引起NOD-樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活，白細胞介素-1β（IL-1β）釋放和β 細胞凋亡。因此，胰腺TXNIP 蛋白可能是抗胰島β 細胞凋亡、保護胰腺的重要靶點。目前臨床常用治療藥物主要通過控制血糖延緩糖尿病并發癥的發生與發展，部分磺酰脲類降糖藥物長期應用甚至引起胰島素分泌耗竭，因此胰腺保護作用的天然藥物發現成為研究熱點。

鞣花酸（Ellagic acid，EA）是一種天然多酚二內酯，來源于葡萄、草莓、石榴等水果及堅果。研究發現鞣花酸具有抗氧化、抗炎及抗癌等作用［5-6］，能減輕2 型糖尿病雌性大鼠肝臟氧化應激和胰島素抵抗［7］。但EA 是否能通過TXNIP／NLRP3 信號通路抑制胰腺炎癥從而發揮胰腺保護作用不清楚。本研究以高脂飼料（HFD）聯合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的2 型糖尿病模型小鼠為研究對象，在明確EA 具有減輕胰腺損傷作用的基礎上，探討EA 對胰腺炎癥的影響及機制，從而為EA 的臨床應用開發提供藥理學依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級純種C57BL／6 小鼠，雄性，體質量23～25 g，購于新疆醫科大學動物中心［使用許可證號SYXK（新）2016-0002］。

1.2 藥物與試劑 鞣花酸購于上海麥克林生化科技有限公司（純度≥98%，批號C10393321）；STZ 購于美國Sigma公司（批號WXBC1125）；糖化血清蛋白（GSP）試劑盒（批號A037-2-1）、IL-10 試劑盒（批號H009）、IL-1β 試劑盒（批號H002）均購自上海貝博生物科技有限公司；NLRP3（貨號WL02635）、裂解的半胱氨酸天門冬酸蛋白酶3（cleaved-caspase3）（貨號WL02117）、IL-1β（貨號WL00891）抗體、羊抗兔IgG-HRP（貨號WLA023）購自沈陽萬類生物有限公司；TXNIP（貨號K0502-3）購自北京博爾邁生物技術有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP（貨號HA1006）購自杭州華安生物技術有限公司。普通飼料購于新疆醫科大學動物實驗中心；高脂飼料購于南通特羅菲飼料有限公司。

1.3 儀器 YP202 N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；XS205DU 型分析天平、離心機（MULTIFUGE X3R）、酶標儀（Multiskan GO 1.01.12）、LK20180069 型制冰機（常熟市菱科電器有限公司）、血糖儀（羅氏血糖儀活力型）。

2 方法

2.1 造模、分組 C57BL／6 小鼠適應性飼養1 周后用于實驗，隨機分為正常組、模型組、鞣花酸組，每組10 只。正常組給予普通飼料喂養，造模小鼠給予高脂飼料喂養，6周后禁食不禁水12 h 后高脂飼養的動物連續2 d 腹腔注射STZ（85 mg／kg）誘導糖尿病，正常組腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2 d 后剪尾取血測血糖，以空腹血糖＞11.1 mmol／L為造模成功。

2.2 給藥 高脂飼喂6 周后連續2 d 腹腔注射STZ，造模成功后進行鞣花酸干預8 周。正常組和模型組均灌胃給予蒸餾水（0.1 mL／10 g），鞣花酸組灌胃給藥，給藥劑量為50 mg ／kg，連續給藥8 周。

2.3 血糖檢測 第1、3、5、7 周末小鼠禁食不禁水6 h，稱定體質量，測空腹血糖（FBG）。

2.4 血漿生化指標檢測 鞣花酸干預8 周后，小鼠禁食不禁水 6 h，10% 水合氯醛麻醉小鼠，眼靜脈取血，3 000 r／min離心10 min 分離血漿，分裝，-80 ℃凍存備用。按試劑盒說明書分別檢測血漿糖化血清蛋白（GSP）、IL-1β、IL-10 水平。

2.5 胰組織蛋白表達檢測 取血結束后，處死小鼠，立即取出胰組織，提取蛋白。將各組樣品加入12% 聚丙烯酰胺凝膠中電泳，80 V 恒壓電泳約125 min，待溴酚藍到達玻璃板底時，終止電泳，然后取出凝膠切下目的條帶區，轉膜至PVDF 膜上，加入5% 脫脂奶粉于37 ℃搖床下封閉2 h，加入一抗［TXNIP（1∶1 000），cleaved-caspase3（1∶400），NLRP3（1∶500），IL-1β（1∶500）β-actin（1∶1 000）］于4 ℃孵育過夜。次日TBST 洗膜3 次，5 min／次，加入二抗（1∶5 000）于37 ℃孵育2 h。于Image lab軟件分析蛋白條帶圖像。

2.6 統計學分析 采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，符合正態分布和方差齊性采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；不符合正態分布和方差齊性采用秩和檢驗。以P≤0.05 為差異具有統計學意義

3 結果

3.1 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 和GSP 的影響 與正常組比較，模型組小鼠FBG、血漿GSP 水平升高（P＜0.01）；鞣花酸干預后，小鼠FBG、，血漿GSP 水平較模型組降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 的影響（，mmol／L）

表1 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 的影響（，mmol／L）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組小鼠血漿中IL-1β 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠血漿中IL-1β 水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.01）。見表2。

3.3 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織凋亡蛋白表達的影響 與正常小鼠比較，模型組小鼠胰組織中cleaved-caspase 3 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠胰組織中cleaved-caspase3 蛋白表達減少（P＜0.01）。見圖2。

圖1 EA 對C57BL／6 糖尿病模型小鼠糖化血清蛋白（GSP）的影響

表2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響（，pg／mL）

表2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響（，pg／mL）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織TXNIP／NLRP3／IL-1β 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠胰組織中TXNIP、NLRP3、IL-1β 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠胰腺組織中TXNIP、IL-1β 蛋白表達減少（P＜0.01），NLRP3 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織調亡蛋白表達的影響

圖3 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織TXNIP、NLRP3 和IL-1β 蛋白表達的影響

4 討論

高糖誘導TXNIP 轉錄和蛋白表達上調，進而激活NLRP3 炎癥小體，介導成熟的L-1β 的釋放，2 型糖尿病中TXNIP 蛋白的顯著上調介導的炎癥反應和氧化應激誘導胰島β 細胞凋亡［8］和胰島的功能下降［9］，使無活性的caspase3 變成裂解的caspase3。G.Leibowi 等［10］稱促凋亡因子TXNIP 為胰腺β 細胞糖毒的效應器和2 型糖尿病發生的驅動劑，下調TXNIP 不僅還能改善高血糖癥，而且還能阻止氧化應激引起的胰腺損傷［11-12］。因此，TXNIP 可能成為治療糖尿病及其并發癥的重要靶點之一。

本研究結果表明，高脂聯合STZ 誘導的2 型糖尿病小鼠模型，血糖及血漿GSP 水平升高，炎癥因子水平紊亂，胰腺的促凋亡蛋白cleaved-cas3 表達顯著增加，TXNIP／NLRP3／IL-1β 信號通路激活，提示糖尿病的發生可能與TXNIP 介導的胰腺炎癥信號通路異常密切相關。EA 能降低糖尿病小鼠空腹血糖和血漿糖化血清蛋白水平，還能降低血漿促炎細胞因子IL-1β 水平，升高血漿抗炎細胞因子IL-10 水平，抑制胰腺細胞凋亡蛋白的表達，下調TXNIP 和IL-1β 蛋白表達。提示EA 對糖尿病小鼠胰腺的保護作用可能通過抑制TXNIP、IL-1β 介導的炎癥和凋亡，從而改善高糖脂及STZ 誘發的胰腺組織損傷。

綜上所述，鞣花酸可起到保護糖尿病小鼠胰腺的作用，其機制可能與抑制胰腺TXNIP／IL-1β 炎癥信號有關，本研究對富含鞣花多酚果蔬攝入的益處有新的啟示，為開發抗糖尿病胰腺損傷的天然藥物提供了新的理論基礎。