小兒感冒顆粒對H1N1 流感病毒誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

朱海燕岑利峰史訓龍段娟慧代 志?

（1.復旦大學藥學院，上海201203； 2.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳518110）

999 小兒感冒顆粒是小兒感冒類非處方藥品，是臨床上兒科抗病毒的常用藥，由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍根、地黃、地骨皮、白薇、薄荷、石膏組成，具有疏風解表、清熱解毒的功用。999 小兒感冒顆粒用于小兒風熱感冒，癥見發熱、頭脹痛、咳嗽痰黏、咽喉腫痛的患者。藥品說明書已明確999 小兒感冒顆粒可以治療感冒，但針對病毒感染誘導的呼吸道感染的相關實驗研究未見報道，文獻僅表明999 小兒感冒顆粒在小鼠模型上具有鎮咳祛痰作用［1］。感冒是由病毒或細菌感染所誘發的上呼吸道感染疾病，病毒感染中以流感病毒最為常見，鑒于此，本研究借助甲型流感病毒H1N1 的小鼠模型，研究999 小兒感冒顆粒對流感病毒誘導肺損傷的保護作用，觀察藥物對病毒復制以及對相關炎癥因子、氧化損傷的抑制作用。

1 材料

1.1 動物 BALB／C 小鼠108 只，SPF 級，雄性，體質量（14±2）g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，生產許可證號SCXK（滬）2013-0018。動物適應性飼養1 d，輻照飼料喂養，自由飲水，晝夜明暗交替時間，室溫25 ℃，相對濕度40%。

1.2 病毒株 流感病毒A1 型（H1N1）鼠肺適應株FM1（批號20171002），由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提供，經本研究室（BSL-2 級別）傳代保存，本室已備案，具有操作流感病毒的實驗資質。

1.3 藥物與試劑 受試樣品999 小兒感冒顆粒［由華潤三九（棗莊）藥業有限公司，批號1701012（有效期2019 年12 月）］；利巴韋林原料藥作為陽性藥物（由上海芃碩生物科技有限公司）。脂質氧化（MDA）檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號071717171009）；小鼠IFNγELISA 檢測試劑盒（上海船夫生物科技有限公司，批號M2500）；小鼠IL-10 ELISA 檢測試劑盒（上海船夫生物科技有限公司，批號M3400）；小鼠TNF-αELISA 檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司提供，批號12／2017）；小鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司提供，批號1508251）。Alsever 氏液由枸櫞酸鈉（二水）8.0 g／L、枸櫞酸（一水）0.55 g／L、葡萄糖20.5 g／L、氯化鈉4.2 g／L 組成，溶解后于121 ℃下滅菌15 min 備用。公雞紅細胞懸液由公雞血按比例為1∶1 迅速混合制備，保存于Alsever 氏液中，冷藏待用。

1.4 儀器 Tissuelyser-24 多樣品組織研磨機（上海凈信實業發展有限公司）；Allegra 64R 臺式高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）；JY12001 電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；EPOCH 超微量微孔板分光光度計（美國BioTek 公司）；Forma 702 超低溫冰箱（美國Thermo Scientific 公司）；AF100 制冰機（意大利Scotsman 公司）。

2 方法

2.1 分組 受試動物預飼養1 天，按體質量隨機分為正常組、病毒對照組、陽性藥物對照組（利巴韋林100 mg／kg）及999 小兒感冒顆粒低、中、高劑量組（3、6、12 g／kg）。

2.2 受試藥物配制 稱取利巴韋林原料100 mg，加入0.5% CMCNa 溶液10 mL，配成10 mg／mL 利巴韋林工作口服液。小鼠給藥劑量0.2 mL／20 g，1 次／d。取999 小兒感冒顆粒適量，6 g／袋，用熱蒸餾水研磨，定容配制質量濃度分別為200、400、800 mg／mL 999 小兒感冒顆粒溶液，灌胃給藥體積0.3 mL／20 g，1 次／d。

2.3 稀釋毒種及攻毒方法 取甲型流感病毒FM1 H1N1 鼠肺適應株，以1640 培養基稀釋成濃度約為2×LD50（相當于儲存液1×10-5稀釋）的病毒液，冰浴保存。除正常組外，其余各組腹腔麻醉后，以滴鼻法感染，左右鼻孔各15 μL，共30 μL／只。攻毒后2 h，開始灌胃給藥，進行急性肺損傷試驗和生存保護試驗。

2.4 藥物對流感病毒感染小鼠的死亡保護試驗 BALB／C鼠，每組12 只，麻醉后經滴鼻感染2×LD50的流感病毒2 h后，灌胃給藥，1 次／d，共給藥7 d。各組小鼠均自感染之日起觀察2 周，觀察小鼠發病癥狀，記錄體質量、死亡時間、死亡數；計算死亡率、死亡保護率、平均生存時間和生命延長率。生命延長率＝［（治療組平均存活天數-病毒對照組平均存活天數）／病毒對照組平均存活天數］×100%。

2.5 藥物對流感病毒感染小鼠的肺損傷保護試驗 BALB／C 鼠，每組6 只，麻醉后經滴鼻感染2×LD50的流感病毒2 h后，灌胃給藥，1 次／d，共給藥4 d，病毒感染96 h 后取材，取肺拍照，稱定肺質量，體質量，進行肺病變評分，計算肺指數（肺質量mg／體質量g）。肺組織用PBS 勻漿，離心，分裝凍存，待測。

2.6 病毒感染鼠肺中的病毒效價的測定方法［2］感染后96 h，每組取6 只小鼠脫頸處死，摘取肺臟，取全肺加生理鹽水2 mL 研磨制成勻漿，離心，取上清。按照常規方法做微量血凝試驗，以出現“＋＋”的肺勻漿上清做為最高稀釋度為血凝終點，該稀釋度即為病毒的血凝效價。將待測鼠的肺均漿液0.1 mL 作為最高濃度，用PBS 進行系列的對倍稀釋加入血凝板中，各孔病毒血凝素的稀釋度順序為1，1／2，1／4，1／8，1／16，1／32，每孔量為0.1 mL 肺勻漿稀釋液。各孔分別加入1%雞紅細胞懸液0.1 mL，立即搖勻，直立靜置，避免震動。放室溫經30 min，45 min、1 h 各觀察1 次。以45 min 的觀察結果為準。每次試驗至少包括一個血球陰性對照組，即于孔內加0.1 mL 鹽水和0.1 mL 1%雞紅細胞懸液。

2.7 病毒感染鼠肺中細胞因子、脂質過氧化產物的測定方法 參照ELISA 試劑盒說明書，分別配制標準品和稀釋肺勻漿樣品，按說明書操作，分別檢測肺勻漿中的TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10 水平。參照試劑盒說明書，按說明書操作，檢測肺勻漿中的MDA 產物的變化。

2.8 統計學分析 應用Graph Pad Prism 5.0 軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析分析，組間比較采用Dunnett’s test 檢驗，計數資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。以P≤0.05 表示差異具有統計意義。

3 結果

3.1 感冒顆粒對流感病毒感染鼠的生存保護作用 病毒對照組感染小鼠7 d 后開始出現死亡，到第9 天共死亡10 只，余2 只存活至14 d。病毒感染后小鼠體質量前2 天保持穩定增長，第3、4 天體質量開始下降，直至出現死亡，存活的動物在感染第9 天后，體質量逐漸回升（圖2）。999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染后小鼠生命有保護作用，能延長病毒感染鼠的生命存活時間，降低死亡率。第14 天，低、中、高劑量999 小兒感冒顆粒平均存活時間分別為10.3、11.0、13.5 天，動物生命延長率分別為11.8%、19.1%、47.2%（表1）；病毒對照組14 d 后生存率為16.7%，99 小兒感冒顆粒低、中、高劑量組能顯著提高生存率，分別達到41.7%、58.3、91.7%，利巴韋林治療組生存率達到100%（圖1）。與病毒對照組相比，高劑量治療組顯著性提高動物體質量。

表1 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠死亡保護和延長生命的作用

圖1 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠生存保護的作用

圖2 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠體質量的影響

3.2 999 小兒感冒顆粒對流感病毒急性感染鼠肺損傷的保護作用 病毒感染小鼠在感染4 d 后體質量未見顯著增長，肺部充血水腫導致肺質量增加，肺指數升高。999 小兒感冒顆粒高、中、低劑量組能降低肺指數，減少肺部充血的面積，減輕肺水腫的程度，降低肺表觀病變率；其中，與病毒對照組比較，高劑量組肺表觀病變率，低、高劑量組肺指數差異具有統計學意義（P＜0.05）。利巴韋林作為陽性治療藥物能降低病毒感染鼠的肺指數（P＜0.01）。見圖3～5。

圖4 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺表觀病變的作用（n＝6）

圖5 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺指數的作用（n＝6）

3.3 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺中病毒復制的抑制作用 流感病毒的表面主要存在血凝素和神經氨酸酶兩種蛋白，血凝素能促進紅細胞的凝集，病毒血凝滴度實驗就是通過觀察紅細胞的凝集狀況，判斷病毒的復制程度。本實驗結果顯示，病毒感染4 d 后小鼠肺臟中的病毒增殖活躍，血凝素效價增高。999 小兒感冒顆粒高、中、低治療組對雞紅血球凝集都有一定的抑制活性，流感病毒感染的靶器官組織的病毒拷貝都有一定程度的減少，但差異無統計學意義，陽性藥對照組具有顯著的抗病毒活性（P＜0.01）。見圖6。

圖6 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿血凝素效價的作用（n＝6）

3.4 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺勻漿中干擾素的影響 IFN-γ 主要由活化的Th 細胞和NK 細胞產生，其生物學功能主要是免疫調節，誘導多種抗原提呈細胞表達MHC-I／II，活化單核、巨噬細胞并分泌IL-6、TNF-α 等。同時IFN-γ 主要通過與細胞表面受體的結合，誘導病毒感染細胞產生多種病毒蛋白，使細胞內產生抗病毒狀態而發揮抗病毒作用，其抗病毒作用是非特異的。結果顯示，病毒感染4 d 后小鼠肺臟中的IFN-γ 水平升高（P＜0.05），999小兒感冒高劑量組IFN-γ 水平升高（P＜0.05），陽性藥對照組的IFN-γ 未見升高。見圖7。

表2 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿血凝素效價的抑制作用

3.5 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺勻漿中炎性細胞因子的影響 TNF-α 是主要的促炎細胞因子，主要由活化的巨噬細胞，NK 細胞及T 淋巴細胞產生，病毒感染過程中，TNF-α 是主要誘導免疫損傷的效應細胞因子。結果表明，病毒感染小鼠第4 天，小鼠肺中TNF-α 水平升高（P＜0.01），反應肺部免疫過度激活，炎性滲出，與病理形態一致。999 小兒感冒顆粒高、中、低劑量組對肺部的TNF-α水平均有抑制作用（P＜0.01），陽性藥對照組也具有的抑制活性。見圖8。

圖7 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿IFN-γ 的作用（n＝6）

圖8 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿重TNF-α 的作用（n＝6）

IL-6 是主要促炎細胞因子，由激活的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，能被IL-1β 和TNF-α 誘導，參與炎癥反應。結果表明，病毒感染小鼠第4 天，鼠肺中IL-6 水平升高（P＜0.01），肺部局部免疫過度激活。999 小兒感冒顆粒對肺部的IL-6 的水平有抑制作用，尤中高劑量組與病毒組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），陽性藥對照組的抑制IL-6 水平（P＜0.01）。見圖9。

IL-10 主要由淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞產生。在炎癥、免疫及增殖等方面均有調節作用，是一種多功能的細胞因子。在肺的急性炎癥期，IL-10 具有抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 和MIP-1 等炎癥介質表達，是一種重要的抗炎性細胞因子，對免疫應答主要起抑制作用。結果表明，病毒感染小鼠第4 天，鼠肺中IL-10 水平降低（P＜0.01），反應肺部局部的免疫防御激活。999 小兒感冒顆粒對肺部的IL-10 的分泌有升高作用，其中高劑量治療組與病毒組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），陽性藥對照組對IL-10 水平沒有作用。見圖10。

圖9 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿IL-6 的作用（n＝6）

圖10 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿IL-10 的作用（n＝6）

3.6 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺勻漿中丙二醛（MDA）的影響 MDA 是脂質過氧化，也是細胞氧化損傷的一個重要檢測指標。文獻已證實病毒感染的病理條件下，ROS 產生過多，氧化系統活性下降，引發脂質過氧化反應損傷細胞膜，使細胞受損。流感病毒感染過程中，氧自由基的大量產生，機體不能及時清除這些自由基，進而導致肺泡組織細胞脂質過氧化，引發肺泡組織的廣泛性損傷。結果表明，病毒感染小鼠第4 天，鼠肺中MDA 水平增高（P＜0.01），反應病毒增殖誘導肺部氧化損傷加重，與病理形態一致。999 小兒感冒顆粒對肺部的MDA 水平具有抑制作用，但差異無統計學意義（圖11），結果顯示藥物具有一定抗氧化損傷作用。

4 討論

999 小兒感冒顆粒是用于治療兒童感冒的常用中成藥，雖臨床應用已久，但其抗病毒活性尚未見報道。本實驗通過生存和急性肺損傷實驗，研究999 小兒感冒顆粒對流感病毒誘導肺損傷的保護作用，并通過檢測細胞因子、血凝素效價等指標探討其抗病毒及抗炎機制。

圖11 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿MDA 的作用（n＝6）

生存試驗結果顯示，999 小兒感冒顆粒3 個劑量組能增加病毒感染鼠的存活率（分別為41.7%、58.3%、91.7%），延長生命存活時間，并且能提高動物體質量，表明999 小兒感冒顆粒對甲型流感病毒感染鼠具有顯著的保護作用。急性肺損傷試驗結果顯示，999 小兒感冒顆粒組能減輕H1N1 病毒感染鼠肺部的充血及水腫，降低鼠肺指數，抑制肺部的TNF-α、IL-6 的炎性因子分泌，增加抗炎因子IL-10 以及IFN-γ 的表達，其中以高劑量組效果最佳。此外，999 小兒感冒顆粒對流感病毒的復制以及脂質過氧化產物MDA 都呈現一定的抑制活性，但差異無統計學意義。結果表明，999 小兒感冒顆粒對甲型流感病毒感染誘導的肺損傷，具有顯著的保護作用，具有抗炎的活性和免疫調節功能。

隨著研究的深入，越來越多的證據表明病毒誘導的肺損傷的過程是個多因素相互作用的結果，在流感病毒感染的小鼠模型中，病毒的持續復制和宿主的過度免疫應答是造成鼠肺部損傷的2 個主要因素。H1N1 流感大流行造成的高死亡率主要是由過度的免疫應答所引發的“細胞因子風暴”所致，而細胞因子風暴即是由感染H1N1 引起的體內炎性細胞因子／趨化因子大量的產生，引起的急性呼吸窘迫綜合癥和器官衰竭的重要原因［3］。

病毒被吸入體內，即可通過病毒與血凝素受體結合入侵宿主，激活多種模式識別受體，包括TLR、RIG-1、NOD2，激活NF-κB 等轉錄因子，進而誘發干擾素和細胞因子，發揮病毒防御以及病毒清除的作用。感染的最初0～4 h內，誘發瞬時的固有免疫防疫應答，當病毒突破機體屏障后，感染后的96 h 內主要由固有免疫應答發揮作用，包括補體、巨噬細胞、NK 細胞、干擾素（INF）等。IFN 主要通過與靶細胞表面受體結合，激活細胞內抗病毒蛋白基因，抑制病毒蛋白質合成，從而抑制病毒增殖。H1N1 甲流病毒的感染，不僅在肺上皮細胞中復制，在巨噬細胞等免疫細胞中也復制，激活NF-KB、STAT 等信號通路，最終釋放TNF-α、IFN-α／β、MIP-1、IP-10、IL-1β、IL-6 等蛋白的過度表達，與疾病的輕重成呈正相關，引發致死性的病理損傷［4-7］。

傳統醫學認為流感屬“瘟疫”“溫病”等范疇，感受非時之氣或疫癘之邪，999 小兒感冒顆粒是針對“風、熱，毒”的組方。方中廣藿香疏風解表，化濕和中；連翹清熱解毒，輕宣透表，共為君藥。菊花、薄荷疏散上焦風熱，清利頭目；大青葉、板藍根淸熱解毒，消腫利咽，共為臣藥。地骨皮、白薇清熱泄火涼血；石膏清解氣分實熱；地黃淸熱涼血，滋陰生津，共為佐藥。諸藥合用，共奏疏風解表，清熱解毒功用［8］。表里雙解，在表疏風散熱，在里清氣分熱兼涼血，截斷病勢。與流感病毒固有免疫階段的病理發展特征，恰好契合。

999 小兒感冒顆粒處方有十味中藥，其成分復雜。雖復方的抗病毒藥效尚未見報道，但單味藥的研究已為復方抗病毒的治療提供了很多實驗依據。廣藿香、連翹、板藍根、大青葉、菊花、薄荷中的單體或單藥提取物已證實具有體內、外的抗流感病毒活性［9-13］。本研究結果初步闡明了復方具有顯著抑制病毒誘導的肺損傷的藥效，并證實其藥效與抗病毒、抗炎及免疫調控機制有關，部分阻斷致死劑量病毒感染誘發的高細胞因子血癥，加速機體對病毒的清除，上調干擾素的表達，抑制了過度的免疫病理損傷。由于復方的機制研究的復雜性和系統性，其確切機制有待進一步研究。

綜上所述，999 小兒感冒顆粒對流感病毒誘導的肺損傷的保護作用可能是通過抗病毒、抗炎、免疫調控途徑來實現的。