補氣活血生發酊對小鼠雄激素性脫發的影響

景 林余志杰胡婷婷劉蜀坤彭春橋孫 濤?

（1.成都中醫藥大學公共衛生學院，四川 成都611137； 2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都611137）

正常的脫發是指一種頭發自行脫落的現象。病理性的脫發是指頭發過度脫落或者異常脫落。在所有的脫發中尤以雄激素性脫發最為常見，是一種常見的慢性皮膚病［1］。該病雖多見于青壯年男性，但也有少量女性患者。男性雄激素性脫發患者一般表現為發際線后移乃至一發不生，而女性常表現為頭發彌漫性稀疏。據統計，我國約有25%的成年男性正飽受脫發疾病的困擾。目前脫發已成為臨床皮膚科高發疾病之一，給患者的身心健康帶來巨大的負擔，是一種臨床亞健康的表現。近年來，隨著社會的發展，生活節奏的加快，某種程度上加快了該病發病率的升高。目前該病的有效治療方法局限、研究進展緩慢，故該類疾病的針對性治療研究仍是相關科研工作的熱點，且理論和臨床意義重大。用于治療雄激素性脫發的實驗研究及臨床研究文獻較多，相關作用機制目前主要是與雄激素代謝異常等有關，但研究較分散，機制還有待進一步明確。成都中醫藥大學附屬醫院研制的補氣活血生發酊（外用生發酊劑），由側柏葉、紅花、黃芪等中藥組成，具有通絡生發、益氣養血的功效，治療雄激素性脫發。據此，本實驗探究補氣活血生發酊治療雄激素性脫發藥效學評價及機制。

1 材料

1.1 藥物 補氣活血生發酊（臨床經驗方，批號150703）由黃芪、側柏葉、紅花等配伍組成，生藥量為0.2 g／mL。將配方藥材與75% 乙醇（1∶5）回流提取3 次，1 次／h。首次提取液移出另存，剩下2 次提取液減壓濃縮直至無醇味，與首次提取液混勻，然后低溫冷藏72 h 后過濾，調整濾液乙醇體積分數為55%，制成1 000 mL 酊劑。陽性藥2%米諾地爾（山西振東安特生物制藥有限公司，批號20170604），臨床用法為1～2 次／d，1 mL／次，每天用量小于等于2 mL，本次實驗中，每只每次給藥0.24 mL，1 次／d。

1.2 給藥劑量換算 補氣活血生發酊成人每日劑量，按照成人頭皮平均表面積為600 cm2計算，給藥1 次／d，6 mL／次，則臨床上成人每天單位面積皮膚用藥量為（6 mL／次×1 次／天）÷600 cm2＝0.01 mL／cm2。本次實驗小鼠給藥面積為2 cm×3 cm＝6 cm2則給藥量為（6 mL／次×1 次／天）÷600 cm2×6 cm2＝0.06 mL。將臨床用量折算的等效劑量作為本次實驗的低劑量。實驗分為補氣活血生發酊高、中、低劑量組，其生藥量分別為200、100、50 mg／mL，每只每次給藥0.24 mL，1 次／d。

1.3 動物 SPF 級，KM 小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g。由成都達碩實驗動物有限公司提供，檢驗檢疫后備用。動物生產許可證號SCXK（川）2015-030。

1.4 試劑 丙酸睪酮注射液（天津金耀藥業有限公司，批號1508221）；血清睪酮試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180302）；雌二醇試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180302）；肝細胞生長因子（HGF）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180302）；多聚甲醛（合肥白鯊生物科技有限公司，批號1707182）；無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號2014051001）；氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號L117110801）；石蠟（中國石油化工有限公司，批號69018961）；BSAO（北京索萊寶生物科技有限公司，批號714094）；DAB 濃縮型試劑盒（上海長島生物技術有限公司，批號FL-6001）；中性樹脂（上海長島生物技術有限公司，批號G8590）；廣譜二抗（上海長島生物技術有限公司，批號D2004）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司，批號PICPI23223）；RIPA 組織細胞快速裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號R0020）；Tris-HCl，pH 8.8 電泳緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號T1010）；Tris-HCl，pH 6.8電泳緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號T1020）；10% SDS（北京索萊寶生物科技有限公司，批號S1010）；10% 過硫酸銨（北京索萊寶生物科技有限公司，批號A1030）；TEMED（北京索萊寶生物科技有限公司，批號T8090）；蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號P1015）；蛋白預染Marker（加拿大Fermentas公司，批號SM1811）；NC 膜（美國millipore 公司，批號HATF00010）；PBS 磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號P1010）；脫脂奶粉（北京索萊寶生物科技有限公司，批號D8340）；Tween-20（北京索萊寶生物科技有限公司，批號T8220）；發光液（美國millipore 公司，批號WBKLS0100）。

1.5 儀器 U410-86VarioskanFlash 酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；allegra X-30 r centrifuge 高速冷凍離心機（美國beckman coulter 公司）；Tanon-5200 成像系統（上海天能科技有限公司）；TE77XP 電轉儀（美國Hoefer 公司）；mini protean 3 cell 電泳儀（美國Bio Rad 公司）；BSA224SCW 分析天平（德國Sartorius 公司）；CK40-F200 倒置顯微鏡（日本Olympus Optical 公司）；Milli-Q reference 超純水制備儀（德國默克密理博公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；GZX-GF 干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）；SHHW21-600 電熱恒溫水箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SB-5200DTDN 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XW-80 A 旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 造模 取清潔級、健康并且毛發正常，體質量（20±2）g，成年KM 小鼠90 只，雌雄各45 只，每只小鼠分籠飼養，每只按照相關規定進行編號。每只小鼠在其頸下平行背部用苦味酸標出2 cm×3 cm 的區域，作為脫毛觀察區。所有小鼠在合適的環境中適應性喂養1 周。將丙酸睪酮注射液用優質的注射用油進行稀釋，超聲處理，待混勻后配成質量濃度為5 mg／mL 的溶液。隨機選取20 只作為空白組，其余小鼠不分組。參照參考文獻［2-4］造模方法，除空白組注射生理鹽水外，其余未分組小鼠按照5 mg／kg 的劑量進行背部皮下注射，持續注射28 d 丙酸睪酮注射液，建立所需模型。空白組給予等量的生理鹽水，形成對照。造模結束后，分別從造模組和空白組中各隨機選出10 只小鼠，頸部脫臼處死，評價模型是否成功。

2.2 造模成功評價標準 造模成功的標準可以通過肉眼觀察、組織病理學以及血清學相關指標進行判定。如圖1 所示，肉眼觀察結果，在開始造模3 周后，注射了丙酸睪酮的小鼠背部毛發光澤度漸失，毛發顏色灰暗，易斷，繼續注射丙酸睪酮1 周后實驗小鼠背毛逐漸出現脫落。模型組小鼠背部毛發相比于空白組小鼠毛發稀疏，未脫毛發變得纖細、易斷。毛發脫落一般從頭部向尾部發展，小鼠毛發油膩。如圖2、表1～2 所示，病理學結果，可見毛囊微小化，毛囊變細、變小；總毛囊數量減少，終毛／毳毛比例下降。如圖3、表3 所示，血清學指標結果，血清睪酮T 升高；雌二醇降低；T／E2 的比值升高；HGF 降低。此時可認為雄激素性脫毛模型建立成功。

表1 組織病理學表現

圖1 小鼠造模體征結果

圖2 小鼠造模毛囊橫切及縱切面

圖3 Western bolt 檢測HGF 蛋白表達

表2 造模對小鼠總毛囊數、終毛數、毳毛數、終毛／毳毛的影響（， n＝10）

表2 造模對小鼠總毛囊數、終毛數、毳毛數、終毛／毳毛的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表3 造模對小鼠T、E2、HGF 的影響（， n＝10）

表3 造模對小鼠T、E2、HGF 的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0.01。

2.3 分組及給藥 取模型組60 只SPF 級健康成年小鼠，隨機分為模型組、55%乙醇組、米諾地爾擦劑組及補氣活血生發酊低、中、高劑量組，每組雌雄各5 只，每只小鼠分籠飼養。模型組不給藥，55%乙醇組和米諾地爾擦劑組分別給予55%乙醇0.24 mL／只，20 mg／mL 米諾地爾擦劑0.24 mL／只。補氣活血生發酊高、中、低劑量組分別給予補氣活血生發酊生藥量200、100、50 mg／mL，每只0.24 mL。1 次／d，連續涂抹30 d。

2.4 肉眼及毛發鏡觀察小鼠毛發脫落情況 實驗最后1 天肉眼及使用毛發鏡觀察小鼠毛發脫落情況。實驗整個期間對各組小鼠背部給藥區皮膚局部是否紅腫、水腫、糜爛、滲液等異常現象進行觀察并記錄。

2.5 小鼠病理組織及毛囊相關指標檢測 實驗結束時處死所有小鼠，取背部實驗區皮膚（面積約2 cm×3 cm）進行相應處理，觀察毛囊的縱切面及橫斷面；并在顯微鏡（×100）下對毛囊數、終毛及毳毛數進行統計，計算終毛／毳毛的比例。

2.6 小鼠血清睪酮T、雌二醇以及HGF 的測定 第8 周實驗結束時，小鼠進行眼眶采血，常溫靜置30 min，5 000 r／min 離心10 min，移出血清，于-80 ℃冰箱保存，按照試劑盒中所列方法檢測小鼠血清睪酮T、雌二醇以及HGF 水平。

2.7 免疫組化及Western Blot 法檢測HGF 蛋白表達 實驗結束時處死所有小鼠，取背部實驗區皮膚（面積約2 cm×3 cm），-80 ℃保存。按照免疫組化及WB 相關操作步驟對HGF 蛋白表達進行測定。

2.8 統計學分析 采用SPSS 22.0 進行統計分析。計量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析。以P≤0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠毛發脫落情況 如圖4 所示，空白組背部標志區域毛發，未見明顯毛發脫落；模型組、55% 乙醇組背部標志區域毛發明顯減少、變薄、毛色灰暗無光澤；米諾地爾擦劑組背部標志區域毛發較空白組少而薄，可見毛發脫落區域，毛色無變化；補氣活血生發酊低劑量組背部標志區域毛發較空白組略薄而少，可見少量毛發脫落區域，毛色光澤；補氣活血生發酊中劑量組背部標志區域毛發較空白組略薄而少，偶見少量毛發脫落區域，毛色光澤；補氣活血生發酊高劑量組背部標志區域毛發較空白組略薄而少，未見毛發脫落區域，毛色光澤。如圖5 所示，毛發鏡下，空白組小鼠毛發濃密，皮膚完全，基本不見裸露皮膚；模型組、55%乙醇組毛發明顯變少、細小、脫落，可明顯看到裸露皮膚；米諾地爾擦劑組背部毛發變少，未見小塊裸露皮膚；補氣活血生發酊低劑量組背部毛發變少，可見小塊裸露皮膚；補氣活血生發酊中劑量組毛發稍微減少，少見小塊裸露皮膚；補氣活血生發酊高劑量組毛發大致相同，未見小塊裸露皮膚。

圖4 補氣活血生發酊對小鼠毛發的影響（肉眼觀察）

圖5 補氣活血生發酊對小鼠毛發的影響（毛發鏡觀察）

3.2 皮膚毛囊縱切面情況 如圖6 所示，空白組毛囊數量及生長期毛囊數量多，毛囊呈活躍增生狀態；模型組和55%乙醇組毛囊數量減少，生長期毛囊數量減少，增生不活躍，休止期及退行期毛囊增多，皮下組織明顯變薄；米諾地爾擦劑組及補氣活血生發酊低、中、高劑量組生長期毛囊較多，增生較活躍，皮下組織較空白組和55%乙醇組均略有變薄，4 組之間毛囊增生狀態區別不大。

圖6 各組小鼠用藥后毛囊縱斷面比較（HE，×100）

3.3 皮膚毛囊橫切面情況 如圖7 所示，空白組，毛囊和終毛很多，毳毛比較少；模型組、55% 乙醇組，視野內可見毛囊總數減少；米諾地爾擦劑組、補氣活血生發酊低、中、高劑量組，毛囊總數較空白組略少，終毛數減少，毳毛增多，4 組間差異不明顯。

圖7 各組小鼠用藥后毛囊縱斷面比較（HE，×100）

3.4 皮膚組織毛囊數、終毛數、毳毛數及終毛／毳毛比值情況 如表4 所示，與空白組比較，模型組、55% 乙醇組毛囊數、終毛數減少（P＜0.01），55%乙醇組毛／毳毛比值減少（P＜0.05）；與模型組和55%乙醇組比較，米諾地爾擦劑組和補氣活血生發酊組毛囊數、終毛數均增加（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 補氣活血生發酊對小鼠毛囊數、終毛數、毳毛數及終毛／毳毛比值的影響（， n＝10）

表4 補氣活血生發酊對小鼠毛囊數、終毛數、毳毛數及終毛／毳毛比值的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與55%乙醇組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

3.5 補氣活血生發酊對小鼠血清睪酮、雌二醇和HGF 水平的影響 如表5 所示，與空白組比較，模型組、55% 乙醇組血清睪酮水平升高（P＜0.01），雌二醇和HGF 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組、55% 乙醇組比較血清睪酮水平降低（P＜0.01），雌二醇和HGF 水平增加（P＜0.05）。

3.6 補氣活血生發酊對小鼠皮膚組織HGF 蛋白表達的影響 免疫組化結果顯示，與空白組比較，模型組、55% 乙醇組皮膚組織HGF 蛋白表達減少（圖8、表6）。Western blot 結果也顯示，與空白組比較，模型組、55%乙醇組皮膚組織HGF 蛋白表達減少，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖9。

表5 補氣活血生發酊對小鼠血清中睪酮、雌二醇和HGF 水平的影響（， n＝10）

表5 補氣活血生發酊對小鼠血清中睪酮、雌二醇和HGF 水平的影響（， n＝10）

圖8 免疫組化檢測小鼠HGF 蛋白表達

表6 免疫組化檢測小鼠HGF 蛋白表達結果（， n＝8）

表6 免疫組化檢測小鼠HGF 蛋白表達結果（， n＝8）

圖9 Western blot 檢測小鼠HGF 蛋白表達

表7 Western blot 檢測HGF 蛋白表達結果（， n＝8）

表7 Western blot 檢測HGF 蛋白表達結果（， n＝8）

注：與空白組比較，＃P＜0.05。

4 討論

臨床上將脫發類型分為斑禿、雄激素性脫發、內分泌生理性改變脫發、內分泌異常性改變脫發等多種類型［5］。其中雄激素性脫發患病率高、病情頑固、治療困難，是臨床上最常見的脫發病之一。雄激素性脫發是一種常見的遺傳性疾病，其和雄激素的表達失常存在一定的相關性，研究結果表明其發病的主要原因為遺傳易感性及頭皮毛囊局部雄激素代謝紊亂。雄激素性脫發表現出明顯的家族遺傳特征，Hamilton 對家族遺傳與雄激素性脫發的關系進行了研究，且證實了這二者的相關性［6］。毛囊體積及毛囊密度漸漸變小，終毛逐漸轉化為毳毛，終毛／毳毛比值逐漸降低是雄激素性脫發的主要病理表現。西醫認為雄激素性脫發原因主要來自以下幾個方面，毛發生長周期及毛囊的改變（生長期／休止期比例下降、轉化生長因子的表達在雄激素與其受體結合后增加，誘導了毛乳頭細胞的凋亡及毛囊休止期的延長）、雄激素的作用、雄激素受體（Androgen receptor，AR）基因變異，其中激素代謝異常與之高度相關。此外，研究發現雄激素性脫發和二氧睪酮（DHT）的表達水平存在密切的相關性［7-8］，而其表達升高和毛囊單位的Ⅱ型5α 還原酶有一定關系［9］。睪酮（T）是男性的主要雄激素，在毛囊內可檢測到DHT 和雌二醇（E2）等相關的物質，DHT 進入到頭部區域后和毛囊內的Ⅱ型5α-還原酶結合形成一定的復合物，這些復合物進入毛囊細胞，可以對毛囊內的凋亡信號通路起到一定的調節作用，進而影響了真皮乳頭與毛囊細胞的信號傳導機制，且引發微型毛囊轉變，從而導致脫發［10］。而由性腺分泌的E2 可以起到一定促進毛囊生長的作用。在正常情況下，睪酮與E2 的水平一般是固定的，且二者相對平衡。但在5α-還原酶的活性很高時，睪酮能夠轉化為DHT，DHT 的活性顯著高于睪酮，這樣其可以高效地結合雄激素從而導致毛囊內這二者的平衡比例被打破，引發毛發脫落。在毛囊的生長周期中很多因子的表達水平都出現了一定的變化，而這些因子可以調節毛囊的生長過程。其中HGF 因子可以促進表皮細胞的分裂，且加速了其分化，試驗研究發現，HGF 對人類體外培養毛囊的生長有一定促進作用，但所得結果存在一定的差異［11-14］。范衛新等［15］在進行此方面的研究時，通過RTPCR 技術分析了齊墩果酸對小鼠觸須毛囊生長周期毛囊HGF 的影響，結果表明這種物質可以提高毛囊HGFmRNA的表達水平，并據此發揮了促進毛發生長的效果。因此在本實驗中，除了對試驗小鼠毛發一般觀察、皮膚組織切片觀察之外，對小鼠睪酮、E2 及HGF 也進行測量，研究結果表明涂抹補氣活血生發酊后，試驗小鼠體內睪酮水平降低、E2 及HGF 升高，激素平衡狀態得以恢復。

綜上所述，補氣活血生發酊育發機制可能與其調節了動物體內激素的水平有一定關系。它明顯降低模式小鼠體內睪酮水平，提高E2 水平，調節小鼠體內激素的水平，從而促進毛發的生長。