CRISPR基因編輯技術及其應用與檢測方法

石偉佳 劉芳

摘要：CRISPR/Cas9系統作為一個簡單、有效的基因編輯技術，自2012年誕生以來已經成為各個領域的研究熱點，被譽為21世紀目前為止生物技術領域的重大突破。本文討論了CRISPR/Cas9的進展，根據其未來的發展潛力綜述了基因編輯技術在植物上的應用前景。

關鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;檢測方法

中圖分類號：S-3? ? 文獻標識碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200229005

收稿日期：2019-12-10

1.1CRISPR/Cas9的發展歷程

CRISPR/Cas9是一種RNA介導的適應性免疫系統，可以保護細菌和古生菌免受病毒或質粒的侵襲。早在1987年日本研究者在大腸埃希菌編碼的堿性磷酸酶基因附近發現了一些短的串聯重復序列和間隔序列，但其作用機制還不清楚[1]。隨著深入的研究，到2002年，這些特殊的序列被科學家正式命名為CRISPR。發現其可以與附近的Cas蛋白在功能上協同作用[2]。2005年，研究發現成簇間隔的短回文重復序列與免疫功能有關，是細菌在長期進化過程中形成的一種抵御外來DNA入侵的保護機制[3]。隨著研究的不斷深入，2008年，相關試驗證明CRISPR作用在DNA的靶序列上，并證實了間隔序列可以轉錄加工成為成熟的crRNA [4]。2012年，Jinek等在新型基因編輯技術CRISPR的研究取得巨大進步，其發現了Cas9蛋白，并表示Cas9是TypeⅡ型的標志性蛋白質，由2種RNA指導核酸內切酶對目標DNA結合并進行剪切[5]。2013年，利用CRISPR/Cas9切割人類細胞基因組的CC5基因，并表現出與人工嵌合RNA同樣的效果[6]。2016年，在微生物中發現2個新類型的CRISPR-Cas，將其命名為CRISPR/CasX和CRISPR/CasY[7]。2017年，我國科學家首次將基因編輯技術用于干細胞的遺傳增強[8]。到目前為止，該技術廣泛應用于基因治療、疾病模型構建、核酸檢測、動植物品種培育等領域，CRISPR-Cas9技術的廣泛應用證明了這項發明的重要意義。

1.2 CRISPR/Cas9系統的組成與分類

CRISPR/Cas9是由crRNA，反式激活crRNA（trans-activatIngcrRNA， tracrRNA）和Cas蛋白3部分組成，3部分在DNA結構上依次排列并形成tracrRNA，crRNA以及Cas9蛋白形成復合物，使其在特定的靶位點進行切割。Cas9蛋白含有HNH和RuvC功能域，HNH負責剪切與crRNA互補的DNA鏈，RucV負責剪切雙鏈DNA的另一條鏈（圖3）。由間隔序列相鄰基序（protospaceradjacent motIf，PAM）指導Cas9蛋白可以精準的切割外源DNA。PAM位于結合區域的上游并與結合區域相鄰，通常是NGG（N為任意核苷酸，G為鳥嘌呤）3個堿基。在實際操作中，為了更加簡單的操作，Jinek等通過接頭將crRNA和tracrRNA合并成為1條RNA鏈，從而形成單一指導RNA（single-guideRNA，sgRNA）。人工設計gRNA時，結合的區域也就是20nt，其位于gRNA的5'末端，作為指導序列靶序列互補配對。簡單來說，改造后的CRISPR/Cas9系統僅需要在sgRNA指導下，就能完成Cas9蛋白對特定位點的剪切。

CRISPR/Cas9系統可以分為3類，分別是TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，TypeⅠ類型普遍存在于Cas3蛋白，Cas3是一種解旋酶/核酸酶，但是與DNA核酸酶和解旋酶活性不同。TypeⅡ類型是Cas9蛋白所必需的，其包含Ruvc結構域和HNH結構域，這2個結構域對Cas9內切酶活性至關重要。TypeⅢ類型需要大量的RAMP蛋白、Cas6和Cas9蛋白參與到crRNA對目標DNA的切割。TypeⅢ類型不需要識別外源DNA序列上的PAM序列，但仍有降解外源DNA的能力，從而使其成為一個非特異性系統。

1.3CRISPR/Cas9系統作用原理

CRISPR/Cas9可以產生與目標序列互補的RNA序列，并通過堿基互補配對的方式形成RNA-DNA結構，之后，使Cas9核酸內切酶對靶DNA剪切形成雙鏈斷裂的DNA（double strand break， DSB）。產生的DSB可以通過同源定向修復（homology-directed repair， HDR）途徑修復，也可以通過非同源末端鏈接（nonhomologous end-joining， NHEJ）途徑修復。CRISPR/Cas9系統的作用機制可以總結為以下3步。

1.3.1第1步

外源DNA的入侵，外來的DNA首先被Cas蛋白識別，并隨后整合到CRISPR位點的2個相鄰的重復序列之間的間隔。

1.3.2第2步

CRISPR-RNA的產生，當外源物質再次入侵時，整合了外源DNA片段的CRISPR基因座轉錄生成pre-crRNA和tracrRNA，pre-crRNA被核酸酶Ⅲ與tracrRNA切割形成成熟的cr-RNA[9]。

1.3.3第3步

CRISPR/Cas9系統剪接，pre-crRNA和crRNAs形成復合物，通過堿基互補配對原則特異性識別外來的DNA（或RNA），這種復合物降解外來DNA并維持噬菌體的免疫，此外，Cas9蛋白還可以與復合物形成結合，識別外來DNA序列上的PAM序列，行駛剪接功能（圖2）。

2CRISPR/Cas9在植物中的應用

2.1基因敲除

CRISPR/Cas9導致特定基因下調或破壞目標基因的表達，在很多植物中成功應用。如在玉米上，美國杜邦公司利用CRISPR/Cas9技術成功敲除玉米中編碼淀粉合成酶的糯質基因Wx1，從而培育出新的糯玉米品種[11]。在水稻上，CRISPR/Cas9誘導水稻轉錄因子編碼基因OsERF922的靶向突變，從而增強其對稻瘟病真菌病原體的抗性[10]。利用水稻密碼子優化Cas9基因，采用水稻U3啟動子啟動sgRNA轉錄，對水稻中的PDS基因定點突變，獲得了純合的基因敲除突變體[6]。在番茄上，用CRISPR/Cas9技術敲除番茄slmapk3基因，相對于野生型植株，突變體表現出嚴重的葉片枯萎和彎曲，因此可以更深入地了解SlMAPK3基因介導的干旱調控機制[12]。

2.2同時編輯多個基因座

隨著CRISPR/Cas9系統的在植物中不斷的應用，其可以實現對多個基因同時編輯。該作用的發揮需要Cas9與多種不同的sgRNA融合來實現。如，嵌合導向RNA（cgRNA）可以靶向小麥中2種不同的基因肌醇加氧酶（inositol oxygenase， inox）和八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase， pds）基因[13] 。

2.3基因置換

利用CRISPR/Cas9技術可以實現靶基因置換或敲入，將外源DNA整合到基因組中所需的位點。如，將潮霉素磷酸轉移酶基因（hygromycin phosphotransferase，HPT）通過同源重組的方法成功整合到大豆的第4條染色體上[14]?；蛑脫Q可以通過Cas9-sgRNA載體共轉化實現，或者通過合成含有供體序列或與單一供體序列的Cas9-sgRNA的表達盒。

2.4產生無標記的轉基因植物

轉基因可以將外源基因隨機的整合到染色體上，還可以通過水平基因轉移到同一物種的非轉基因植物或者其它物種的植物上。然而，CRISPR/Cas9基因編輯系統可以避免這種現象發生，sgRNA與Cas9形成復合體，指導Cas9對特定序列進行精確突變，其作用對象不是整條染色體。CRISPR/Cas9復合體會在細胞內降解，不會遺傳給下一代。已經在小麥中利用CRISPR/Cas9引入DNA或RNA，并通過瞬時轉化愈傷組織細胞的方法，可以得到無轉基因的、純合的T0代小麥突變體[15]。

3基因編輯與傳統轉基因技術的比較

轉基因技術（Transgentic Technology）是指從植物中分離得到或經過修飾的目的基因導入到植物體內，使其在植物體內穩定表達和遺傳。簡單說，轉基因是將外源DNA隨機整合到染色體上，所以，轉基因技術無論是在過程中還是在最后得到的植株中都會涉及外源DNA的導入。利用CRISPR/Cas9在最后得到的植株中不存在外源DNA，是將DNA序列插入到染色體的特定位置上與傳統的育種方式得到的植株無法區分，所以，基因編輯技術相對更容易被接受且更安全。美國農業部宣布，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術的到的蘑菇和玉米不屬于轉基因監管的范圍[16];利用CRISPR/Cas9基因編輯技術可以精確目標位點，使基因型與表型聯系起來，減少了篩選轉基因植株導致的DNA隨機插入的樣本數量，從而可以確切的判斷基因的功能，使研發時間和成本有所下降?？傊没蚓庉嫷玫街参镏胁缓修D基因成分，相比之下，更容易被人們接受。

4基因編輯植物檢測方法

利用CRISPR/Cas9系統剪切的DNA雙鏈，經過細胞的自我修復，將DNA雙鏈連接起來，沒有涉及到外源基因的加入，獲得的植物中不帶任何標記，與經過基因突變的植物并無明顯區別。

目前對基因編輯植物檢測最常用的方法是PCR/RE。利用該方法需要滿足的條件是gRNA靶序列內存在限制性酶切位點。經基因編輯得到的陽性植株靶序列的酶切位點突變，而不能被內切酶識別，而野生型植株中存在酶切位點可以被相應的酶識別。該方法可以檢測單等位基因和雙等位基因突變，但是不能區分雙等位基因純合子或雜合突變體[17]。

還有一種檢測方法-Sanger測序法，該方法在檢測植物編輯中也較為常用。但是該方法只能確定靶序列是否發生突變，不能對突變類型進一步確定。PCR-Sequencing最終也是利用Sanger法，該技術通過對PCR產物測序，對測序結果的峰值進行比較，確定基因組位點是否發生突變[18]，雖然這種方法確定突變位點較為精確，但是此方法費時、費力，只適用于對少量的靶位點進行分析，對于公司或者大批量檢測基因編輯來說效率不高。

CRISPR/Cas9作為第3代基因編輯系統，近幾年的迅速發展和應用領域的拓展，其在基因編輯的精確性和高效性方面已經不可替代，受到科研人員的重視和關注。利用基因編輯技術得到的植物新品種中不存在外源DNA，可以使植物的培育過程更加安全。開發出一個省時、省力、高效的方法來檢測基因編輯的植物，這也使科研人員所面臨更大的挑戰。

5展望

CRISPR/Cas9作為一種操作簡單、有效、精確度高的基因編輯技術，廣泛應用于各個領域。盡管CRISPR/Cas9被成功用于植物基因組編輯，但也存在很多風險。如，最小化脫靶機制，并闡述這種機制，如何對CRISPR/Cas9系統進行優化，以及開發出一種對植物基因組編輯檢測的有效方法。這需要對CRISPR/Cas9系統進行更加深入的研究，以促進CRISPR/Cas9基因編輯技術在未來會創造更大的價值。

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