抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的中藥化學成分虛擬篩選△

雷蕾，楊策，亢力，邢雁輝，武紅莉，王忠*

1.中國中醫科學院 中醫藥信息研究所，北京 100700；2.中國中醫科學院 中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphy lococcus aureus，MRSA)是多藥耐藥性感染的最常見原因之一，具有顯著的發病率和病死率，已成為醫院感染和社區獲得性感染的重要病原菌之一[1]。隨著MRSA對所有種類的抗生素逐漸產生耐藥性，它變得越來越難以控制。因此，筆者們一直在尋找新的藥物來對抗MRSA。

中醫藥是我國醫學瑰寶，隨著中醫藥現代化發展，越來越多的中藥化學成分被分離出來，為新藥開發提供了寶貴的資源。已經有很多從天然產物中開發出新藥的例子，例如青蒿素的開發[2]和長春堿的開發[3]。然而，傳統生物測定篩選的成本高昂。近年來，分子對接方法已成為計算機輔助藥物研究領域的一項重要技術。它是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物篩選的方法，可以有效地在進行傳統生物學測定之前進行虛擬篩選，從而降低新藥開發的成本，并提高命中率。

本研究收集了文獻中有抗菌或者抑菌報道的中藥以及中藥包含的化學成分，希望篩選出可能具有抗MRSA的化合物。因此，使用分子對接的方法對283味中藥中包含的6193個化學成分與常見MRSA抑制靶標青霉素結合蛋白2a(PBP2a)進行了分子對接，得到的研究結果希望能給新藥開發人員以有價值的參考。

1 資料與方法

1.1 平臺和軟件

本研究所有工作均在Microsoft Windows 2007操作系統中完成，采用Accelrys 公司的Discovery Studio 4.5(DS4.5)軟件。參數設置除特殊指明，均為默認值。本研究使用的是CDOCKER程序，是基于CHARMm的柔性對接程序，采用soft-core potentials以及optional grid representation將配體分子與受體活性位點進行對接。首先采用動力學的方法隨機搜索小分子構象，隨后采用模擬退火的方法將各個構象在受體活性位點區域進行優化，從而使對接結果更加準確。分子的吸收、分布、代謝、排泄、毒性(ADMET)計算也是使用DS4.5完成的。

1.2 受體的準備

PBP2a的3D結構(PDB ID：3ZG0，2.60 ?)從Protein Data Bank網站下載(https：//www.rcsb.org/)。MRSA具有多重耐藥性，其產生機制是PBPs改變的結果，高度耐藥性是由于原有的PBP2與PBP3之間產生一種新的PBP2′(即PBP2a)，低、中度耐藥是PBPs的產量增多或與甲氧西林等親和力下降所致。

PBP2a晶體學研究給出了抑制劑與蛋白在變構位點和活性位點相互作用的信息，變構結合域位于距離dd-轉肽酶活性位點60 ?的位置。當配體在變構位點占用時，多殘留構象變化在活性位點達到頂峰，從而允許抑制劑進入[4]。3ZG0是蛋白與2個分子的ceftaroline(頭孢洛林)共結晶體，配體ceftaroline(ID：1W8)成功觸發了PBP2a構象變化，使蛋白的活性部位可以與另一個ceftaroline分子(ID：AI8)結合。ceftaroline是FDA批準的抗MRSAβ-內酰胺抗生素。目前3ZG0已經用于抗MRSA藥物的虛擬篩選[5-6]。

本研究受體的準備和結合口袋的定義為刪除水分子、原配體分子及其非相關的蛋白質構象，經clean protein工具處理，再加CHARMm力場進行能量優化，定義蛋白為受體，以它的原配體位置為中心，選擇半徑0.50 nm 范圍的殘基為活性殘基，將其定義sphere球，此范圍內的空腔為結合口袋，最后保存備用。

1.3 配體數據的組建

檢索中國生物醫學文獻數據庫(SinoMed)、中國期刊全文數據庫(CNKI)，萬方數據庫和維普數據庫。檢索詞有：“抑菌”“抗菌”“藥理作用”。時間限制為1949年1月—2017年12月。納入標準：采集對中藥或者中藥提取物的藥理作用進行研究的文獻。排除標準：排除文獻研究、綜述、非藥理實驗文獻、理論探討、臨床研究、單體成分藥理實驗報道以及重復報道的文獻。數據由人工摘錄的方式從文獻中收集與中藥、中藥提取物和藥理作用相關的信息。在本研究中，中藥提取物統一為中藥名稱，例如黃芩乙醇提取物規范統一為黃芩，梔子提取物統一為梔子。最后，根據計算系統生物學實驗室TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，檢索出化學成分。

因為中藥常水煎口服，在體內需經吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)以及排泄(excretion)過程，這個過程簡稱ADME。為了預測化合物ADME的性質，本研究以口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為條件篩選化合物。將化合物的mol2格式文件導入DS4.5中，首先依據Linpiski規則進行篩選，然后使用small molecules-prepare ligand進一步將配體產生三維結構，加氫，產生異構體等。最后使用small molecules-minimize ligands，加CHARMm力場進行能量最小化，保存為分子對接的配體分子集。

1.4 對接方法可信性驗證

含有原配體的蛋白晶體復合結構，將原配體抽離，然后按設定的參數對接回其結合口袋，計算對接后最高打分的構象與原配體結構的均方根偏差值(RMSD)，一般RMSD≤0.20 nm[7]則認為該對接方法可行，說明該套參數能較好地重現此配體與受體的結合模式。

1.5 配體分子與受體靶點對接參數

將上述配體和受體導入DS4.5，調用CDOCKER對接模塊，參數均為默認值。

變構位點結合口袋的位置是X=9.965 744，Y=52.253 615，Z=23.244 846，結合口袋的半徑為11.520 969 ?。

活性位點結合口袋的位置是X=-35.986 667，Y=44.388 051，Z=66.823 564，結合口袋的半徑為12.883 887 ?。

1.6 結果處理

對接完成后，以原配體的對接interaction energy為參考，值高于原配體的予以保留，得到潛在有活性的化合物。

2 結果

2.1 抑菌抗菌中藥統計

本研究共檢索出252篇文獻，一共出現283味中藥，其中頻次在前10位的見表1。

表1 文獻檢索頻次在前10位的抑菌抗菌中藥

2.2 化學成分統計

在283味中藥中包含了6193個化學成分，以OB≥30%和類藥性DL≥0.18為條件篩選出化合物1137個。進一步使用Linpiski規則篩選出907個化合物。Lipinski規則，即類藥五原則(rule of five)，其內容如下：1個小分子藥物中要具備以下性質：分子量<500；氫鍵給體數目<5；氫鍵受體數目<10；脂水分配系數<5；可旋轉鍵的數量不超過10個。

2.3 可行性驗證結果

選取3ZG0含有原配體的復合結構晶體，將原配體抽離，再對接回其結合口袋，計算對接后構象與原配體結構的RMSD 值，<0.2 nm說明該對接方法、所選用的晶體結構及參數的設定可行。

2.4 變構部位分子對接

將原配體ceftaroline對接回變構部位結合口袋，得到interaction energy為-54.89。完成對接后，能量低于它的化合物有66個，結合能最低的10個化合物見表2。

2.5 活性部位分子對接

將原配體ceftaroline對接回活性部位結合口袋，得到interaction energy為-68.65，能量低于它的化合物有6個，見表3。

2.6 作用模式分析

為了研究突變體結構與活性化合物的結合親和力，進行了作用模式的分析。變構位點在整個對接過程中至關重要，必須先有1個分子與變構位點結合，觸發PBP2a構象變化，使蛋白的活性部位可以與另1個分子結合，從而達到抗MRSA的作用。實際上，PBP2a表現出耐藥性，是因為在PBP2a的變構位點(146位和150位)上發生了2個氨基酸的變化，這2個氨基酸的變化對頭孢類藥物產生了抗藥性，導致了頭孢類藥物耐藥MRSA菌株的增加[4]。本研究發現了23個化合物與146位氨基酸殘基可以通過氫鍵和范德華力結合。而在3ZG0活性位點上，6個化合物除了范德華力和氫鍵外，還通過鹽橋、ππ相互作用等與周圍的蛋白質殘基相結合。

本研究發現，不論是變構部位還是活性部位，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt都能以較為穩定的構象與3ZG0結合。syringaresinol diglucoside_qt是syringaresinol diglucoside的去糖基的代謝產物，可以認為是腸道菌水解產物。也就是說，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt就像一把鑰匙，1個分子可以先與變構位點結合，觸發PBP2a構象變化，使蛋白的活性部位可以與另1個分子結合，從而達到抗MRSA的作用。

表2 變構部位結合能最低的10個化合物

續表2

表3 活性部位結合能低于原配體的化合物

續表3

3 討論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對目前所有廣譜抗生素都表現出耐藥性，對公眾構成嚴重威脅。在中藥抗耐藥菌的研究中，田應彪等[8]觀察了五倍子、黃連、黃柏等16種中藥水煎液對MRSA和MSSA體外抑菌作用，黃文玉等[9]發現了大蒜、馬齒莧、野菊花等27種清熱解毒中藥對葡萄球菌耐藥菌株的作用，謝大澤等[10]報道了黃連等中藥對淋菌耐藥菌株體外抗菌活性的研究工作。中藥逐漸在耐藥菌的研究中嶄露頭腳，因此本研究希望可以從具有抗菌抑菌作用的中藥中尋找到抗MRSA的候選物，進而為新藥開發提供參考。

為了能夠盡可能地篩選出候選物，在進行虛擬篩選之前，本研究就使用化合物的ADME的性質和Lipinski規則進行了初步篩選。這一方面可以減少分子對接的計算量，另一方面可以保證最后得到的化合物會有更好的藥代動力學性質，在生物體內代謝過程中會有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。摒除了那些不適合成為藥物的分子，縮小篩選的范圍，并降低藥物研發成本。

PBP2a蛋白結構很特殊，它有一個變構位點，一個活性位點。變構位點就像一扇門，打開了它，活性位點才能有效結合藥物分子。本研究發現了66個可以與變構位點良好結合的中藥化學成分，它們都可以作為鑰匙打開第一扇門。同時發現了6個可以與活性位點良好結合的成分。值得一提的是，不論是變構部位還是活性部位，來自甘草和山豆根的lupiwighteone和來自女貞子的syringaresinol diglucoside_qt都能以較為穩定的構象與3ZG0結合。也就意味著lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt有可能像上市藥物ceftaroline一樣，以2個分子的形式與PBP2a蛋白相結合，從而達到抗MRSA的目的。