以7種有效成分為指標評價內蒙古不同產地黃芪藥材品質△

李紫巖，楊敏，王杰，張春紅*，李旻輝，2*

1.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014060；2.內蒙古自治區中醫藥研究所，內蒙古 呼和浩特 010110

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，2015版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)規定黃芪藥材以黃芪甲苷與毛蕊異黃酮苷為指標成分[1]。此外，芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ為黃芪中含量較高的有效成分，經常與《中國藥典》規定的指標成分一起用來綜合評價黃芪的品質[2-5]。為了合理利用土地，科學指導黃芪栽培種植基地的選址，本研究以黃酮類和皂苷類7種有效成分作為指標，采用HPLC-UV與HPLC-ELSD對內蒙古不同產地的黃芪藥材進行指標成分含量測定，并根據含量測定結果對不同產地黃芪藥材進行聚類分析，直觀地將不同產地的黃芪藥材品質進行初步評價比較。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國熱電公司)；2000ES型蒸發光散射檢測器(美國奧泰科技有限公司)；XWK-Ⅲ型空氣發生器(天津市津分分析儀器制造有限公司)；梅特勒ME204型十萬分之一天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；XJB-40-B型純水儀(沈陽欣潔科技有限公司)；FLBP-200型粉碎機(浙江屹立工貿有限公司)；KDM型控溫電熱套(菏澤精科儀器有限公司)；IKA RV 10型旋轉蒸發儀(上海焓佩機電設備有限公司)；索式提取器、回流提取器、容量瓶等玻璃儀器均產于四川蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.2 試藥

色譜甲醇、正丁醇、磷酸均購于天津市福晨化學試劑廠，色譜乙腈購于天津市科密歐化學試劑有限公司，氨水購于天津市風船化學試劑科技有限公司，超純水由XJB-40-B型純水儀制得。毛蕊異黃酮苷對照品(批號：150326)、芒柄花苷對照品(批號：150507)、毛蕊異黃酮對照品(批號：151208)、芒柄花素對照品(批號：140601)、黃芪甲苷(批號：148321)、黃芪皂苷Ⅱ(批號：140413)、黃芪皂苷Ⅰ(批號：16061307)均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度≥98%。黃芪樣品采集基于第四次全國中藥資源普查項目，共選取具有代表性的40份樣品，生長年限均為2年，經包頭醫學院張春紅教授鑒定為蒙古黃芪的干燥根，粉碎過40目篩并保存于4 ℃環境中備用，樣品詳細信息見表1。

表1 黃芪樣品信息

續表1

2 方法與結果

2.1 黃酮類成分的方法學考察與含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱：Thermo BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)；梯度洗脫(0～35 min，25%～60%A；35～45 min，60%A)；流速：1.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。HPLC圖見圖1。

注：A.黃酮類化合物對照品；B.黃芪樣品：1.毛蕊異黃酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊異黃酮；4.芒柄花素。圖1 黃酮類化合物對照品與黃芪樣品HPLC圖

2.1.2對照品溶液制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素4種黃酮類成分對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成含毛蕊異黃酮苷0.25 mg·mL-1、芒柄花苷0.1 mg·mL-1、毛蕊異黃酮0.06 mg·mL-1、芒柄花素0.015 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液制備 精密稱取黃芪粉末4.0 g于圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，稱質量。加熱回流3 h，放冷，補足損失的液體質量，過濾并濃縮至干，用甲醇轉移至5 mL容量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4線性關系考察 精密吸取對照品混合溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μL，按2.1.1項下色譜條件，注入HPLC中測定，分別記錄毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮類成分的峰面積。選擇質量濃度(X)作為橫坐標，選擇峰面積值(Y)作為縱坐標，進行線性回歸，得到4種黃酮類成分的線性回歸方程。毛蕊異黃酮苷：Y=45.083X-0.027 8，r=0.999 9；芒柄花苷：Y=60.778X-0.010 6，r=0.999 8；毛蕊異黃酮：Y=116.51X+0.010 5，r=0.999 9；芒柄花素：Y=102.9X+0.205，r=0.999 7。表明毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素分別在0.000 025～0.002 5、0.000 01～0.001、0.000 006～0.000 6、0.000 001 5～0.000 15 mg·mL-1質量濃度范圍內線性關系良好。

2.1.5精密度試驗 取2.1.2項下的對照品溶液，按照2.1.1項下所述色譜條件連續進樣6次，分別記錄4種黃酮類成分含量的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的RSD分別為0.17%、0.23%、0.18%、1.47%。表明所使用儀器精密度良好。

2.1.6穩定性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末1.0 g，按2.1.3項下所述方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.1.1項下色譜條件進行HPLC分析，記錄黃酮類成分的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.16%、1.28%、1.81%、1.92%。表明本方法在24 h內穩定性良好。

2.1.7重復性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末1.0 g，按2.1.3項下所述方法平行制備供試品溶液6份，按2.1.1項下所述色譜條件進行HPLC分析，記錄黃酮類成分峰面積。將峰面積進行偏差分析，得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.79%、0.98%、0.81%、1.13%。表明測定方法的重復性良好。

2.1.8加樣回收率試驗 精密稱取黃芪樣品粉末0.5 g，按2.1.3項下所述方法平行制備6份供試品溶液，分別加入與樣品中各待測成分相當的對照品溶液，按照2.1.1項下所述色譜條件進行測定，分別計算出毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均回收率。加樣回收率試驗結果：毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均回收率和RSD分別為96.93%、1.78%，90.40%、1.58%，105.00%、1.59%，92.08%、1.70%。結果數據詳見表2，表明本試驗方法的準確性良好。

表2 黃芪中黃酮類化合物的加樣回收率測定結果(n=6)

2.1.9黃酮類成分含量檢測 將40份不同產地黃芪樣品分別按照2.1.3項下方法制備成供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進行HPLC分析，將所得峰面積帶入相對應的回歸方程，計算得到各產地樣品中黃酮類成分的含量，測定結果詳見表3。結果表明不同產地樣品中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素質量分數范圍分別在0.021 6%～0.150 3%、0.002 6%～0.060 2%、0.000 2%～0.012 5%和0.000 3%～0.013 5%，各產地毛蕊異黃酮苷的含量符合《中國藥典》規定。

2.2 黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的方法學考察與含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜乙腈(A)-超純水(B)；梯度洗脫(0～15 min，5%～30%A；15～40 min，30%～50%A)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；蒸發光檢測器漂移管溫度：110 ℃；載氣流速：3 L·min-1；進樣量：10 μL。HPLC圖見圖2。

注：A.皂苷類化合物對照品；B.黃芪樣品；1.黃芪皂苷Ⅱ；2.黃芪皂苷Ⅰ。圖2 皂苷類化合物對照品與黃芪樣品HPLC圖

2.2.2對照品溶液制備 分別精密稱取黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ對照品適量，置于5 mL容量瓶中，加入適量甲醇并使其溶解，定容至刻度，搖勻，配制成含黃芪皂苷Ⅰ 0.782 mg·mL-1、黃芪皂苷Ⅱ0.254 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.2.3供試品溶液制備 精密稱取黃芪粉末4.0 g置于索氏提取器中，加入適量的甲醇，連續回流提取5 h，提取液蒸干，用甲醇轉到5 mL容量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4線性關系考察 精密吸取對照品混合溶液1、2、4、8、16 μL，按2.2.1項下色譜條件，注入HPLC中測定，分別記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積。選擇進樣質量的常用對數值(lgX)作為橫坐標，選擇峰面積的常用對數值(lgY)作為縱坐標，進行線性回歸，得到皂苷類成分的線性回歸方程。黃芪皂苷Ⅰ：lgY=1.408 8lgX+5.208 4，r=0.999 2；黃芪皂苷Ⅱ：lgY=1.892 5lgX+6.855 4，r=0.999 6。表明黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ質量濃度分別在0.000 782～0.012 512mg·mL-1、0.000 254～0.004 064 mg·mL-1線性關系良好。

2.2.5精密度試驗 取2.2.2項下對照品溶液，按2.2.1項下所述色譜條件連續重復進樣6次，分別記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ含量的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積的RSD分別為2.04%、1.02%。表明所使用儀器精密度良好。

2.2.6穩定性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末4.0 g，按2.2.3項下方法制備皂苷類成分供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.2.1項下色譜條件進行HPLC分析，記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ在不同進樣時間峰面積的RSD分別為4.73%、3.60%。表明本方法在24 h內穩定性良好。

2.2.7重復性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末4.0 g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液6份，按2.2.1項下所述色譜條件進行HPLC分析，記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ峰面積的RSD分別為2.05%、2.55%。表明測定方法的重復性良好。

2.2.8加樣回收率試驗 精密稱取黃芪樣品粉末1.0 g，按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，分別加入與樣品中各待測成分相當的對照品溶液，按照2.2.1項下所述色譜條件進行測定，計算黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的平均回收率。結果數據詳見表4，表明本方法的準確性良好。

2.2.9黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量檢測 將40份不同產地黃芪樣品分別按照2.2.3項下方法制備成供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進行HPLC分析，將所得峰面積帶入相對應的回歸方程，計算得到各產地樣品中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的含量，測定結果詳見表3。結果表明不同產地樣品中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ質量分數分別為0.023 9%～2.189 0%和0.041 3%～0.391 1%。

表3 黃芪體內有效成分含量測定結果 %

表4 黃芪中皂苷類成分加樣回收率測定結果(n=6)

2.3 黃芪甲苷的含量測定

2.3.1黃芪甲苷的含量測定方法 按《中國藥典》中黃芪藥材規定的方法對黃芪甲苷進行含量測定。

2.3.2色譜條件 色譜柱：Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜乙腈(A)-超純水(B)；等度洗脫：0～20 min，35%(A)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；蒸發光檢測器漂移管溫度：110 ℃；載氣流速：3 L·min-1，進樣量：10 μL。HPLC圖見圖3。

注：A.黃芪甲苷對照品；B.黃芪樣品；1.黃芪甲苷。圖3 黃芪甲苷對照品與黃芪樣品HPLC圖

2.3.3對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加入甲醇使其溶解，定容至5 mL容量瓶中，配制成含黃芪甲苷0.5 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.3.4供試品溶液制備 精密稱定黃芪粉末4.0 g，置于索氏提取器中，加入甲醇40 mL，冷浸過夜，加入適量的甲醇并加熱回流4 h，蒸干，殘渣加入水10 mL，微熱使其溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液部分，用氨試液反復洗滌2次，棄掉氨試液，蒸干，加入5 mL，過D101大孔吸附樹脂柱(內徑為1.5 cm，柱高為12 cm)，分別以50 mL水、30 mL 40%乙醇、80 mL 70%乙醇依次進行洗脫，收集洗脫液并蒸干，用甲醇轉移至5 mL容量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.5線性關系考察 采用外標兩點法建立黃芪甲苷的標準曲線，分別精密吸取其對照品溶液10、20 μL，吸取黃芪供試品溶液20 μL，依次注入HPLC中進行測定，選擇進樣質量的常用對數值(lgX) 作為橫坐標，選擇峰面積的常用對數值(lgY)作為縱坐標，得到黃芪甲苷標準曲線的方程：lgY=1.317 5lgX+4.960 8，r=0.999 3，表明黃芪甲苷在0.005～0.01 mg·mL-1線性關系良好。

2.3.6黃芪甲苷的含量測定 將40份不同產地黃芪樣品分別按照2.3.4項下方法制備成供試品溶液，按照2.3.2項下色譜條件進行HPLC分析，結合標準曲線方程，計算得到各產地樣品中黃芪甲苷的含量。結果表明不同產地樣品中黃芪甲苷質量分數為0.040 7%～0.106 5%，均符合《中國藥典》中黃芪藥材項下限量要求，測定數據詳見表3。

2.4 聚類分析

依據表3中不同產地黃芪體內各有效成分含量，運用SPSS 20.0對不同產地黃芪藥材進行聚類分析，選擇以組間聯結作為聚類方法，距離的計算方法選擇平方Euclidean距離，所得聚類分析結果見圖4。

從圖4中可以看出聚類結果把黃芪樣品分為3類，S10(包頭市固陽縣下濕壕鎮)、S19(包頭市土默特右旗公山灣鄉)產地樣品聚為一類，此類樣品中黃酮類和皂苷類有效成分含量均較其他產地樣品的高。S2～S7、S9、S11～S18、S20～S22、S24～S29、S33、S34(巴彥淖爾市、包頭市、呼和浩特市、烏蘭察布市等地區)產地樣品聚為一類，此類樣品中各指標成分含量較高；S1、S8、S23、S30～S32、S35～S40(阿拉善盟、錫林郭勒盟、赤峰市、通遼市、興安盟、呼倫貝爾市等地區)產地樣品聚為一類，此類樣品中各指標成分含量偏低。

圖4 黃芪樣品聚類分析樹狀圖

3 結論

本文分別使用HPLC-UV和HPLC-ELSD對黃芪藥材中4種黃酮類成分和3種皂苷類成分進行含量測定，試驗方法精密度、重復性好，操作便捷，結果可靠。聚類分析結果表明在陰山山脈及周邊地區所栽培的黃芪有效成分含量積累較高、品質較好，其中山區比山脈周邊農區所產黃芪品質佳，山脈范圍外其他產地的黃芪品質一般。研究結果可為內蒙古地區黃芪栽培基地的選址以及黃芪藥材質量評價體系的建立提供參考。

4 討論

本實驗采用2種不同的HPLC-ELSD方法檢測皂苷類化合物，其中對黃芪甲苷成分的測定采用《中國藥典》黃芪項下規定的方法，進行單獨測定，是由于《中國藥典》采用的方法在提取黃芪甲苷的過程中，其他皂苷類成分經堿處理，乙酰基水解可以轉化為黃芪甲苷[6]，測得值高于藥材中黃芪甲苷的實際含量；如采用本文中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ測定方法同時測定黃芪甲苷，樣品中的黃芪甲苷的含量普遍低于采用《中國藥典》規定方法的測定值，不能用《中國藥典》規定的限量要求進行分析。

依據表3，對不同產區黃芪有效成分含量測定結果進行分析，在蒙西地區(包括阿拉善盟、巴彥淖爾市、包頭市、呼和浩特市地區)采集的樣品中，毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷的平均質量分數分別為0.064 3%、0.064 7%；在蒙東地區(包括錫林郭勒盟、赤峰市、通遼市、興安盟、呼倫貝爾市地區)采集的樣品中，毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷的平均質量分數分別為0.059 9%、0.061 9%。可以發現蒙西地區黃芪樣品的毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷的含量比蒙東地區樣品中的高，結合《中國藥典》對黃芪項下檢測指標的規定，推測蒙西地區可能更適宜藥用蒙古黃芪的種植。黃芪體內的黃酮類成分發揮著抗氧化、消除自由基、抗衰老等作用[7]，黃芪體內的皂苷類成分具有多種調節作用，如免疫調節、心血管調節、抗腫瘤等[8]，這兩類成分都對人類健康發展起到不可忽視的作用。根據黃芪有效成分含量測定結果，可嘗試在樣品中有效成分含量突出的地區建立黃芪的種植基地，并針對某種或某幾種有效成分進行黃芪的大面積培育，以此來供應臨床用藥的需求，這值得深入研究。

分析圖4的聚類結果，S10(包頭市固陽縣下濕壕鎮)、S19(包頭市土默特右旗公山灣鄉)這兩份樣品由于各類有效成分含量較高或最高而被聚為一類，所測定成分含量之和均>2%，此二者產地位于陰山山脈山區，生產面積比較小，生境與野生黃芪相似，栽培管理屬于仿野生栽培模式，是其品質上乘的主要原因。S2～S7、S9、S11～S18、S20～S22、S24～S29、S33、S34(巴彥淖爾市、包頭市、呼和浩特市、烏蘭察布市等地區)產地的樣品由于各類有效成分含量較高而被聚為一類，所測定成分質量分數之和均為1%～2%，此類樣品多生長在陰山山脈的山腳下周邊農業區，并且與內蒙古地區黃芪傳統的道地產地相契合，因此這些地區黃芪樣品的品質較好。S1、S8、S23、S30～S32、S35～S40(阿拉善盟、錫林郭勒盟、赤峰市、通遼市、興安盟、呼倫貝爾市等地區)產地的樣品由于各類有效成分含量偏低而被聚為一類，所測定成分質量分數之和均不足1%，此類樣品未被內蒙古傳統道地產區所囊括，生境可能并不十分適宜黃芪的生長發育，故而黃芪樣品的品質一般。

不同產地的生態環境可能對藥用植物的生長發育以及體內次級代謝產物積累有很大影響，探討生態環境與藥用植物體內有效成分的關聯是近些年來中藥資源領域的又一研究熱點，在藥用植物產地適宜性評價中得到廣泛應用并取得了諸多成果[9-11]，應用中藥適宜性區劃技術，可幫助推動規范化種植GAP生產基地建設以及藥用植物資源的撫育工作。筆者今后將繼續研究不同地區所產黃芪的品質適宜性，通過科學的方法找出最適宜黃芪生產的地區，為中藥資源的保護工作貢獻綿薄之力。