傷科凝膠劑提取工藝研究

侯影，張旭

1.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600

傷科凝膠劑是根據多年臨床經驗方，采用現代制藥技術開發研制成的外用制劑。傷科凝膠劑處方由紅花、馬錢子、三七、續斷等十味中藥組成，根據藥材性質及臨床需要，經實驗選擇的劑型為凝膠劑，以卡波姆-940為基質加工制成。具有止痛消腫、化瘀活血的作用，主要用于瘀血腫痛、跌打損傷等癥。近年來凝膠劑是為滿足臨床需要而發展起來的一種新的藥物劑型，目前國內外研究開發已很廣泛且日漸成熟。常用基質有卡波姆(Carbomer，CBM)、羥甲基纖維素鈉、泊洛沙姆(poloxmner)、甲殼胺、瓊脂、殼聚糖等。凝膠劑基質可以應用卡波姆-940，具有制備工藝簡單、穩定性優異、對皮膚無刺激性、外觀細膩、無油膩、滑爽、干后易清洗等特點，是優良的外用劑型。凝膠劑自身具有液體和固體的雙重特性，從收縮率、導電性、蒸氣壓等方面，可以被看作為液體；從結構上，高濃度凝膠所具有的物質狀態，又可以看作是固體。凝膠劑作為一種透皮吸收好、無油膩感、涂展性好、易于清洗的新外用劑型，可廣泛用于控釋制劑、緩釋制劑及脈沖釋放等新型給藥途徑，適用于皮膚、黏膜、腔道。傳承內病外治的治療理念，既可以避免口服藥經過酶、酸等作用在胃腸道內產生首過效應，且可以降低藥物自身的毒副作用，凝膠劑作為外用制劑已成為近幾年來局部用藥的熱點研究方向。

方中馬錢子為馬錢子科馬錢Strychnosnux-vomicaL.的成熟種子，始見于《本草綱目》[1]。其性溫，味苦，有大毒，主要歸脾、肝經；具有消腫散結，通絡止痛之效。臨床治療風濕頑痹、跌打損傷、麻木癱瘓、咽喉腫痛、癰疽瘡毒、骨折腫痛等方面具有顯著療效[2]。士的寧為馬錢子主要含有的生物堿的單體成分，它既是有效成分，也是有毒成分，中毒劑量與治療劑量相當，口服30～100 mg可以達到致死量[3]，曾有臨床報道，1名69歲男性血樣中含有0.29 mg·L-1士的寧導致死亡[4]。選擇士的寧為實驗考察的指標，為判定處方中藥品質量的實物標準，進而保證藥品的質量[5]。本實驗采用正交試驗設計法，以士的寧提取量為考察指標對凝膠劑的提取工藝進行研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀；微量進樣器(規格：25 μL，Hamilton 美國)；數控超聲波清洗器(型號：KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(型號：RE-52，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(型號：FA1004B，上海精密科學儀器有限公司)；十萬分之一分析天平(型號：METTLER AE240，瑞士METTLER)；酸度計(型號：PHS-2C，上海偉業儀器廠)；低速大容量多管離心機(型號：LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠)；高速粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)。

1.2 試藥

馬錢子、三七等處方中藥均由大連美羅中藥廠有限公司提供。經遼寧中醫藥大學藥學院翟延君教授鑒定為正品。

士的寧對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110706-200505)；乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；庚烷磺酸鈉(上海如吉生物科技發展有限公司)；磷酸(天津市大茂化學試劑廠)；磷酸二氫鉀(天津市大茂化學試劑廠)；乙醇為分析純；水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

硅膠柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱溫：室溫。流動相：乙腈-磷酸二氫鉀(0.02 mol·L-1)與庚烷磺酸鈉(0.01 mol·L-1)等量混合的溶液(pH值為2.8，用10%磷酸調節)(21∶79)。檢測波長：254 nm，測定時間：60 min。

2.2 對照品溶液制備

精密稱定士的寧對照品，置于容量瓶，用甲醇溶解，稀釋至刻度線，制成每1 mL含0.004 mg儲備溶液，即為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

稱取1/4處方量馬錢子、紅花、三七、續斷等十味中藥共9份，每份質量為66 g。按照表2進行正交試驗，采用加熱回流提取的方法，得乙醇提取液，量取提取液體積，取正交設計的9份提取液，每份提取液記錄體積，濾過，精密吸取續濾液2 mL，加入到容量瓶(10 mL)中，加入甲醇溶液進行稀釋，至標準刻度，混合均勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，得到的續濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性供試品溶液制備

取除去馬錢子以外的其他中藥，按優選出的提取工藝提取制備陰性供試品，再參照2.3項下方法制備，備用。

2.5 線性范圍考察

分別精密吸取士的寧對照品溶液(0.004 012 mg·mL-1)2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL，注入液相色譜器儀中，測定色譜峰的峰面積，分別以進樣量為橫坐標(X)、色譜峰面積為縱坐標(Y)，繪出對照品溶液標準曲線圖，得到回歸方程為：Y=1 797.5X-1.133 3，r=0.999 9。士的寧進樣量在0.010 03～0.060 18 μg線性關良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取士的寧對照品溶液10 μL，重復6次進樣，測定士的寧的峰面積。士的寧RSD為0.14%，顯示該方法精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品6份，分別精密稱定，按上述2.1項下的色譜條件和2.3項下供試品溶液制備方法進行測定含量，結果士的寧RSD為0.98%，顯示此方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

選取0、4、8、12、16、20、24 h進樣取同一2.3項下供試品溶液進行分析。結果表明：士的寧RSD為0.76%。說明在制備后24 h內供試品溶液的穩定性良好。

2.9 回收率試驗

同一批樣品(已知士的寧含量)精密稱取0.1 g，依次精密加入一定量的士的寧對照品溶液，按2.3項下的方法操作，同時制備6份，按上述2.1項下色譜條件進行含量測定，計算樣品回收率，士的寧平均回收率為99.75%，RSD為1.19%。

2.10 正交試驗法

2.10.1供試品溶液的含量測定 各精密吸取10 μL供試品溶液、混合對照品溶液，測定士的寧含量，并計算士的寧提取量。士的寧對照品、士的寧正交提取9#供試品、陰性供試品溶液的色譜圖見圖1～3。

圖1 士的寧對照品HPLC圖

圖2 9#傷科凝膠劑供試品溶液HPLC圖

圖3 缺的士寧的陰性供試品溶液HPLC圖

2.10.2因素水平的確定與考察指標 方中馬錢子主要含有的化學物質有馬錢子堿、士的寧、豆甾醇苷、脂肪油、番木鱉苷、棕櫚酸及綠原酸等[6]。其中，生物堿既為其主要有效成分又為其毒性成分。王雪等[7]的研究結果表明，馬錢子堿和士的寧都是具有強烈毒性的物質，其中馬錢子堿的毒性是士的寧毒性的20 倍；相關研究[8-9]表明，口服 5～10 mg 士的寧可出現中毒癥狀，口服30 mg 左右可導致死亡。而在使用一定量的馬錢子后不僅能導致藥源性損傷，還能損害腎小管上皮細胞，繼而誘發腎功能衰竭和尿毒癥等。依據本方中各中藥化學成分的性質，在乙醇中有較好的溶解度，故選擇回流提取的方法。在單因素考察的基礎上，以乙醇溶媒濃度(A)、溶媒量(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為考察因素，以士的寧提取量和浸膏收率為指標，試驗按照L9(34)正交表進行，提取工藝優選因素水平見表1。

表1 傷科凝膠劑提取工藝因素水平

2.10.3正交試驗 稱取1/4處方量馬錢子、紅花、三七、續斷等十味中藥共9份，每份質量為66 g。依據正交試驗表2進行實驗，進行回流提取，得乙醇提取液，量取提取液體積，測定提取液中士的寧含量，并計算士的寧提取量。以浸膏收率綜合評分加權值為0.5，士的寧提取總量綜合評分加權值為0.5，兩者之和為綜合評分，作為考察指標，結果見表2。方差分析見表3。

表2 傷科凝膠劑提取工藝正交表L9(34)試驗設計及結果

表3 傷科凝膠劑提取工藝方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.00。

2.11 實驗結果

從方差分析結果看出，各因素影響均不顯著。本實驗的影響因素主次順序為D>A>C>B，經綜合分析，確定其最佳提取工藝條件為A2B1C2D3。即以60%乙醇為溶媒，提取3次，溶媒為 10、8、8倍量，每次1.5 h。

2.12 驗證實驗

稱取1/4處方量的處方中藥3份，以10、8、8倍60%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液。得乙醇提取液，量取提取液體積，測定提取液中士的寧含量，并計算士的寧提取量，結果見表4。

表4 傷科凝膠劑提取工藝驗證實驗結果

根據驗證結果，士的寧提取量和浸膏收率均略高于正交設計試驗中的考察指標最高提取量，說明優選的提取工藝合理可行。

3 討論

馬錢子主要用于治療類風濕關節炎、風濕關節炎、骨質增生、坐骨神經痛、痛風、骨關節炎、腰肌勞損等疾病，是痹癥治療的主要藥物，臨床上具有較高的應用價值[10-11]。馬錢子有效成分主要為總生物堿，其中70%～80%為馬錢子堿和士的寧，主要作用于心血管系統、中樞系統、免疫系統[12]。研究表明，馬錢子堿(稱布魯生)和士的寧(番木鱉堿) 又是馬錢子的主要毒性成分。其作用機理為對脊髓后角細胞具有高度的選擇性興奮作用，進而使脊髓的運動性反射作用增強，促使感覺器官的敏感性增強，主要作用為延髓血管運動中樞及呼吸中樞的興奮、骨骼肌的緊張度增強，進而使大腦皮質感覺中樞的機能得到提高[13]，表現為強直性的驚厥，因而產生呼吸肌的抑制而致死。作為競爭性抑制甘氨酸受體的士的寧，可以阻斷激活的甘氨酸受體，過度興奮齒狀回神經元使其產生驚厥。同時還具有阻止乙酰膽堿被膽堿酯酶破壞的作用，進而促進胃腸的蠕動，產生腹痛瀉痢。另外，馬錢子具有損害腎小管的上皮細胞的作用，進而破壞氨基酸代謝、脂質的代謝和糖酵解的過程，長期使用可損害人體肝腎功能[14]。臨床目前應用的馬錢子多作為復方制劑，用于鎮痛、抗炎作用多為馬錢子有效成分及其單方外用制劑。

凝膠膏劑是指飲片細粉、提取物、化學藥物和親水性基質(相適宜的)混和均勻后，選擇性地涂布于相適宜的背襯材料，進而制成的貼膏劑。復方馬錢子凝膠膏劑是以卡波姆為基質，制成凝膠膏劑外用，用于治療軟組織炎癥產生的疼痛損傷，具有良好的鎮痛和抑制炎癥作用[15]。外用凝膠膏作為經皮給藥的一種新型制劑，具有保濕性良好、載藥量大、對皮膚無刺激及過敏反應、 可反復粘貼、給藥劑量可以控制，生產過程中對環境無污染等優點，符合中藥大劑量、多組分的用藥特點，是近年來研究經皮給藥的復方中藥新劑型的熱點[16]。

凝膠劑是一種極具發展潛力的新劑型。適用于皮膚、腔道及黏膜給藥，可避免口服給藥存在的首過效應，使藥物不良反應減少，遵循“內病外治”的中醫理念。同時具有使用方便、舒適、易于涂布、外形美觀、不污染衣物、生物相容性好、透皮吸收好等多種優點。近年來，出現的新制藥技術，如包合物凝膠制備技術、殼聚糖凝膠劑制備技術、脂質體凝膠制備技術等，使凝膠劑的應用范圍擴大，而且多種新技術相結合，使凝膠劑質量更穩定、作用更持久，提高生物利用度，并具有皮膚靶向性作用。因此，凝膠膏劑作為一種新劑型，可制成不同的給藥途徑，正得到廣泛的重視和應用。綜上所述，實驗中處方中藥提取工藝考察，以處方中士的寧提取量和浸膏收率為指標，通過正交試驗，確定處方中藥最佳提取工藝為以10、8、8倍60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。結果表明，該提取工藝科學合理、穩定可靠，適合于傷科凝膠劑的工業化提取。