常壓室溫等離子體誘變選育高產酸植物乳桿菌

殷 娜，嚴小玉，馬 珊，張劍林，徐 敏，王犁燁，程方方，武亞婷，劉維兵，武 運

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學 科學技術學院，新疆 烏魯木齊830052：3.新疆維吾爾自治區科技項目服務中心，新疆 烏魯木齊 830052；4.烏魯木齊市奶業協會，新疆 烏魯木齊 830000）

乳酸菌是一類能利用發酵糖類產生大量乳酸的革蘭氏染色陽性、無芽孢的細菌的總稱，在自然界中分布廣泛[1-2]，是人類生活中應用較早的一類微生物，可以起到提高食品風味和改善食品品質的作用[3]。優良的乳酸菌應該具有良好的發酵性和較強的耐受性，從而通過發酵可提高和改善各類乳酸菌發酵食品的營養物質含量以及風味[4]。由于各種不良環境的脅迫及不利因素的影響，嚴重地抑制了乳酸菌的生長代謝能力，進而影響了其益生功能的發揮及高效活性的利用[5]。目前發酵工業和其他微生物生產部門所使用的高產酸乳酸菌菌株，幾乎都是通過誘變育種來提高其生產性能，并且誘變育種具有變異范圍廣泛，類型多樣等優良特點，所以誘變是目前使用較廣泛的一種育種手段[6]。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plas ma，ARTP）是常壓非平衡放電等離子體的一種[7]。常壓室溫等離子體誘變與傳統的誘變方法相比較，其設備更精良，操作方法更簡易，安全系數更高，突變頻率高，更重要的是對環境沒有污染[8]。ARTP所激發出的活性粒子能夠對蛋白質及細胞結構都具有一定的影響，并通過對遺傳物質損傷機制的多樣性，獲得多樣的突變體[9-10]，在多種微生物如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、米曲霉菌（Aspergillus oryzae）和酵母菌種選育中得到成功運用[11-15]。目前在國內已有使用其他誘變方法如重離子束輻照法誘變選育高產酸乳酸菌的研究[16]，且目前利用ARTP誘變選育植物乳桿菌細菌素高產菌株的研究較多[17-19]，但鮮有利用ARTP誘變選育高產酸乳酸菌的報道。

在新疆地區發酵酸乳制品種類多樣，以至于優質乳酸菌種類多樣，地區優勢明顯，更是發展發酵酸乳制品的理想產區[20]。本試驗通過前期從新疆烏魯木齊農牧民家中采集的酸馬乳中分離篩選得到的一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15，以其為出發菌株，采用常壓室溫等離子（ARTP）誘變的方式提高植物乳桿菌YL15產酸量，從而來提高后期研究中驢乳發酵制品的品質，同時為植物乳桿菌的廣泛應用提供理論技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15：新疆農業大學食品科學與藥學學院食品生物發酵與質量安全研究室。

1.1.2 化學試劑

無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；酚酞（分析純）：天津市化學試劑三廠。

1.1.3 培養基

MRS肉湯、MRS培養基：青島日水生物技術有限公司；篩選培養基（含有碳酸鈣的MRS培養基）：在MRS培養基中加入3%的碳酸鈣。

1.2 儀器與設備

ⅡS常壓室溫等離子誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；FA2014N分析天平：北京東南儀誠實驗室設備有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器：上海申安醫療器械廠；HR40-A2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；MJX-100B-Z生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PTX-FA210電子天平：福州華志科學儀器有限公司；SNB-1數字黏度計：上海天美天平儀器有限公司；FE28 Plus pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；TU-1810紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FE20 PLUS pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化和菌懸液的制備

首先將保存于冰箱的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15接種于MRS肉湯液體培養基中，于37 ℃條件下放置培養24 h；然后以2%的接種量接入MRS肉湯液體培養基中，于37 ℃條件下放置培養24 h后，接種到MRS固體培養基中。挑選出單菌落接種到MRS 固體培養基斜面上，并放置在37 ℃條件下培養，在冰箱中保存；最后將斜面上的初始菌接種到MRS肉湯培養基，在37 ℃條件下培養24 h，重復兩次制備菌懸液。

1.3.2 菌株YL15生長曲線的測定

將在MRS肉湯液體培養基中活化好的YL15菌液以4%的接種量接種到MRS肉湯培養基中，在37 ℃條件下培養，每間隔2 h取一次樣，在波長600 nm處測定吸光度值，以空白培養基為對照，根據測得的吸光度值繪制菌株YL15的生長曲線，確定菌株YL15的生長對數期。

1.3.3 ARTP誘變試驗

試驗前期的準備工作：首先用體積分數75%的乙醇對操作臺內部進行擦拭，然后將紫外燈打開殺菌15～30 min。試驗參數：工作氣體選擇純度為99.999%的氦氣（He），氣流量調至10 L/min，電源功率設為120 W，操作溫度為20 ℃，發射源與菌懸液的工作距離為2 mm，試驗處理時間為0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s。

誘變試驗：在無菌條件下吸取1 mL在MRS肉湯中培養至對數期的初始菌株YL15的菌液，在3 000 r/min條件下離心10 min，去掉上清液，吸取10 μL放在載片上，將載片分別放在凹槽中，并將吸有1 mL MRS肉湯的EP管放在下方，便可進行試驗，經過誘變處理后利用旋渦混合器將裝有載片的EP管劇烈振蕩1 min，將載片上的誘變菌全部洗下，梯度稀釋10-6～10-8后，取100 μL涂布于MRS固體培養基上，在37 ℃條件下避光培養48 h，統計菌落數，得到致死率，確定最佳誘變時間。致死率計算公式如下：

式中：Z為菌株的致死率，%；X1為ARTP誘變后的菌落數，CFU；X為對照組的菌落數，CFU。

1.3.4 高產酸乳酸菌初篩

從培養48 h的誘變菌株中挑單菌落點接到篩選培養基上，再點接初始菌株YL15作為對照，在37 ℃條件下培養48 h 后，觀察誘變菌株的溶鈣圈直徑，乳酸菌產生的酸性物質和CaCO3反應而出現溶解圈。測量誘變菌株的溶鈣圈直徑（H）并對誘變菌株的菌落直徑（C）進行測定，計算HC值，即菌株溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值，挑選其中HC值相比于原始HC值大30%的菌株保存，進行下一步復發酵篩選。

1.3.5 高產酸乳酸菌的復篩

復篩的過程是將初篩得到的產酸能力較高的誘變菌株進行活化，并接種到100 mL MRS 肉湯中在37 ℃條件下培養24 h，通過酸度的測定選取發酵酸度較高的菌株為高產酸菌株，挑選其中產酸量較高的正突變菌株進行保存[21]。

1.3.6 遺傳穩定性試驗

將突變乳酸菌菌株連續傳代培養5次，測定每一代突變菌株的產酸能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩定遺傳。

1.3.7 高產酸乳酸菌最適生長條件的研究

將突變菌株在不同溫度與pH條件下進行培養，在波長600 nm處測定吸光度值，從而確定其最適生長溫度與pH值。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌YL15生長曲線

圖1 菌株YL15生長曲線Fig.1 Growth curve of strain YL15

菌株YL15的生長曲線見圖1。由圖1可知，將菌株YL15接入MRS肉湯液體培養基中，前0～6 h菌株YL15生長處于延滯期，增長相對緩慢，OD600nm值變化波動很??；在6～14 h菌株YL15增長迅速，OD600nm值迅速增加，此時菌株YL15處于對數生長期；在18～27 h后植物乳桿菌步入穩定期，27 h后逐漸進入衰亡。在一定程度上乳酸菌菌株在不同生理狀態下對誘變的敏感程度不同，當乳酸菌菌株生長到對數期時，其繁殖力強，生長速度迅猛，且菌種數量以一個穩定的速率增長，對環境因素的影響更為敏感。在對數期進行誘變，可以提高基因突變率和穩定遺傳性[22]。因此，本試驗對處于對數生長期10 h時的菌株YL15進行誘變試驗。

2.2 最佳誘變時間的確定

圖2 不同處理時間對菌株YL15致死率的影響Fig.2 Effect of different treatment time on lethally rate of strain YL15

取菌株YL15懸液，按照1.3.3節誘變條件下進行常壓室溫等離子體誘變處理，然后分別將經過0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s不同處理時間后的突變株數進行統計，計算致死率，結果見圖2。由圖2可知，經過統計得到隨著處理時間的遞增，致死率越來越高，說明乳酸菌對ARTP誘變非常敏感，處理時間為100 s時，致死率達到91.09%；處理時間為120 s時，菌株無存活。當致死率＞90%時，菌株突變產生高產突變的概率相對較高，且菌株在此突變率下恢復突變的概率更小[23]。因此，考慮到乳酸菌的敏感性及ARTP誘變的穩定性，最終將本試驗ARTP 誘變的處理時間確定為100 s。

2.3 誘變菌株初篩結果

挑選單菌落點接到含碳酸鈣的MRS 固體培養基上，再點接初始菌株YL15作為對照，測定菌株溶鈣圈直徑與菌落直徑，計算HC值，結果見表1。

表1 誘變菌株的初篩結果Table 1 Preliminary screening results of mutagenic strains

由表1可知，初始菌株YL15的平均HC值為2.915，通過初篩篩出HC值超出初始菌株YL15 HC值30%的菌株6株，分別為YL15-3、YL15-4、YL15-6、YL15-21、YL15-30和YL15-31，其HC 值范圍在3.824～3.962之間。因此，對初篩出的6株菌株進行進一步復篩。

2.4 誘變菌株復篩結果

圖3 誘變菌株復篩結果Fig.3 Secondary screening results of mutagenic strains

測定6株菌株的酸度，其產酸情況見圖3。由圖3可知，初始菌株YL15的產酸量為10×10-3mol/L，誘變菌株YL15-3：15.4×10-3mol/L、YL15-4：17×10-3mol/L、YL15-6：15×10-3mol/L、YL15-21：16×10-3mol/L、YL15-30：14×10-3mol/L和YL15-31：14.7×10-3mol/L，與初始菌株YL15相比，突變菌株的產酸能力明顯提高，與初篩結果相符。6株突變菌株產酸順序由大到小依次為：菌株YL15-4＞菌株YL15-21＞菌株YL15-3＞菌株YL15-31＞菌株YL15-30＞菌株YL15-6。王璐等[24]在自然發酵蘋果原漿樣品中分離篩選出的植物乳桿菌S3-1024h時的產酸量為10×10-3mol/L，與植物乳桿菌S3-10相比，誘變后的6株菌株的產酸量明顯高于菌株S3-10。通過ARTP誘變能夠改變菌株的某些基因，從而改變菌株的某些特性。因此，最終將突變菌株YL15-4確定為目標菌株。

2.5 遺傳穩定性試驗結果

圖4 菌株YL15-4連續5代產酸情況Fig.4 Acid production of strain YL15-4 for 5 successive generations

將突變菌株YL15-4培養5代，測定每一代菌液的產酸量，結果見圖4。由圖4可知，第二代菌株最高產酸量為17×10-3mol/L，第三代菌株最高產酸量為15×10-3mol/L。雖然5代菌株的產酸能力存在微小差距，但是平均產酸量都維持在16.1×10-3mol/L左右。由此可以表明，突變菌株YL15-4的高產酸性能可以穩定的遺傳。

2.6 誘變菌株的最適生長條件

2.6.1 最適生長溫度

圖5 菌株YL15-4的最適生長溫度Fig.5 Optimal growth temperature of strain YL15-4

在微生物生長繁殖過程中溫度對其影響較大，因此為了充分利用該菌株，對菌株YL15-4最適生長溫度進行測定，結果見圖5。由圖5可知，隨著溫度在30～37 ℃范圍內的升高，OD600nm值呈上升趨勢，溫度在37 ℃時，OD600nm值最大為2.1，溫度在37～45 ℃范圍的升高，OD600nm值呈下降趨勢。因此，菌株YL15-4最適生長溫度為37 ℃。

2.6.2 最適生長pH值

圖6 菌株YL15-1的最適生長pH值Fig.6 Optimal growth pH of strain YL15-1

pH值過高或過低都會嚴重影響菌株的生長，對菌株YL15-4最適生長pH值進行測定，結果見圖6。由圖6可知，在pH值為4.0～5.0范圍內，菌株生長較為迅速，pH值＞5.0之后，OD600nm值有所下降。因此，菌株YL15-4最適生長pH值為5.0。

3 結論

本研究通過以新疆烏魯木齊農牧民家中采集的酸馬乳中分離篩選出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15，在確定工作氣流量、電源功率、操作溫度以及等離子體發射源與菌懸液的距離后，經單因素試驗確定在最佳誘變處理條件為120 W照射100 s。利用篩選培養基及pH測定試驗對照射后挑選的33株突變菌株進行初篩，最后再通過產酸能力測定試驗確定目標菌株為YL15-4，其產酸量為15×10-3mol/L，高于初始菌株的YL15產酸量的50%。突變菌株YL15-4遺傳性能穩定，最適生長溫度為37 ℃，最適生長pH值為5.0。植物乳桿菌在發酵制品、開發功能益生產品方面有更廣闊的應用前景。